作者：李维茹 谭剑平 陈慧 刘玉昆 王振花 王蕴慧 张睿 刘颖琳 张建平
【摘要】 【目的】 探讨静脉滴注免疫球蛋白(ivig)治疗对复发性流产患者(rsa)外周血nk细胞的影响。【方法】 研究组包括31例rsa患者，均进行静脉滴注免疫球蛋白(ivig)治疗，于治疗前后采用流式细胞术检测患者外周血nk细胞毒性及nk细胞在所有淋巴细胞中的比例;26例未接受ivig的rsa患者为对照组，首次检测检测nk细胞毒性及nk细胞比例后，于第10天复查上述项目。【结果】 治疗前研究组nk细胞毒性为(19.7 ± 8.7)%，nk细胞比例为(21.4 ± 8.2)%，治疗后实验组nk细胞毒性为(13.1 ± 3.7)%，nk细胞比例为(19.3 ± 7.5)%;对照组第一次检测，nk细胞毒性为(20.1 ± 7.0)%，nk细胞比例为(21.0 ± 8.1)%，间隔10 d复测，nk细胞毒性为(19.8 ± 7.2)%，nk细胞比例为(21.2 ± 7.7)%。研究组患者ivig治疗前后外周血nk细胞毒性及比例显著降低，差异有统计学意义(p < 0.05)，而对照组前后两次外周血nk细胞毒性及比例无显著差异(p > 0.05);研究组患者ivig前后外周血nk细胞毒性改变与ivig前后nk细胞比例改变没有明显的相关性(p > 0.05)。wwW.11665.com【结论】 ivig治疗对nk细胞毒性及比例产生降调节作用。
【关键词】 复发性流产; 静脉滴注免疫球蛋白; nk细胞毒性; nk细胞比例
abstract： 【objective】 to discuss the influence of intravenous immunoglobulin (ivig) on peripheral blood natural killer cells in women with recurrent spontaneous abortion. 【methods】 there are 31 patients with a history of rsa (recurrent spontaneous abortion) received the ivig. maternal peripheral blood samples were taken from these patients and the nk cell cytotoxicity and percentage were detected before and after the treatment by flow cytometric analysis. twenty control subjects were not receive the treatment. 【results】 before the treatment， the nk cell cytotoxicity in experimental group was (19.7 ± 8.7)% and that was (20.1 ± 7.0)% in control group. after the treatment， the nk cell cytotoxicity in experimental group was (13.1 ± 3.7)% and that was (19.8 ± 7.2)% in the control group. before the treatment， the nk cell percentage in experimental group was (21.4 ± 8.2)% and that was (21.0 ± 8.1)% in control group. after the treatment， the nk cell percentage in experimental group was (19.3 ± 7.5)% and that was (21.2 ± 7.7)%in the control group. in experimental group， the nk cell cytotoxicity and percentage were significantly reduced (p < 0.05) and that in control had not significant difference (p > 0.05). in experimental group， the change of nk cell cytotoxicity and the change of nk cell percentage after treatment were no significant relation (p > 0.05). 【conclusion】 ivig can down regulate the nk cell cytotoxicity and percentage.
静脉滴注免疫球蛋白(intravenous immuno-globulin，ivig)用于复发性流产(recurrent spon-taneous abortion ，rsa)的治疗已在国内外相继展开，并获得了良好的临床效果[1]，但其机制尚不清楚。积极探索ivig的作用机制对ivig的临床应用具有指导意义。自然杀伤细胞(nk cell，natural killer cell)在母胎界面的免疫防御及免疫调节过程中发挥重要作用[2]。外周血nk细胞毒性及比例的升高与rsa患者的不良妊娠结局有关[3]。本研究通过检测ivig治疗前后外周血nk细胞毒性及nk细胞比例来观察ivig对nk细胞的影响，初步探讨ivig治疗的免疫学机制。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选取2008年9月至2009年9月中山二院rsa患者57例作为研究对象，所选患者均曾有≥2次自然流产史(< 孕20周)。免疫学检查无异常：封闭抗体阳性，抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗精子抗体、抗hcg抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体等阴性。查夫妇染色体排除遗传因素，行b超及宫腔镜检查排除解剖因素，甲功、血糖检测排除内分泌因素，行torch、白带常规及宫颈分泌物支原体衣原体检测排除感染因素，通过详细询问病史及内科就诊排除内科疾病因素。研究组31例，对照组26例均停经30 ～ 40 d，血hcg阳性即入院安胎治疗，每日予hcg和黄体酮肌注，对照组知情同意后并给予静脉滴注免疫球蛋白25 g，连用3 d，治疗前均检测外周血nk细胞毒性及nk细胞比例，治疗后7 ～ 10 d予以复查。对照组26例，暂未接受ivig治疗，前后间隔10 d，两次检测其nk细胞毒性及nk细胞比例。
1.2 实验材料
k562细胞株，为nk细胞敏感的靶细胞，购自上海中国科学院细胞库;cd3/cd16+ cd56单克隆抗体(becton dickinson公司)，pi碘化丙啶和pkh2试剂盒(sigma公司)，rpmi1640培养基(gibco公司)，胎牛血清(四季青公司)。
1.3 细胞培养
k562细胞在含100 ml/l的胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的rpmi1640培养基中，37 ℃，体积分数5%co2的条件下培养。待细胞数目增多至约80%，将细胞移至15 ml离心管中，1 000 r/min(r = 15 cm)离心3 min，弃上清液，加入新的培养液，重悬细胞，再将细胞悬液按所需要求的浓度分装入新的培养瓶中培养。
1.4 nk细胞毒性检测
1.4.1 原 理
选用k562细胞株作为nk细胞的靶细胞，将两者共同培养，双标记总的k562细胞以及死亡的k562细胞，k562细胞株与nk细胞共同培养2 h后，流式细胞术检测总的k562细胞及死亡的k562细胞数目，计算k562细胞的死亡率，判断nk细胞对k562细胞的杀伤作用，从而反映nk细胞毒性。
1.4.2 方 法
① 取处于对数生长期的k562细胞2 ml用不含血清的培养洗涤2次，用0.5 ml pkh稀释液重悬。另取pkh稀释液0.5 ml，加入2.5 μl pkh-2染色剂混匀，将此pkh溶液加入重悬后的k562细胞中，室温下反应2 min，取1 ml胎牛血清终止反应。然后再用含有100 ml/l胎牛血清的培养液洗涤3遍。洗涤后用含血清的培养液重悬细胞，将细胞浓度调整为1 × 105/ml备用。②抽取患者肘静脉血10 ml，用密度梯度离心法分离淋巴细胞，加pbs洗涤3次，弃上清，加入含100 ml/l胎牛血清的培养液重悬，通过细胞记数将细胞浓度调整到5 × 106/ml备用。③ 流式细胞检术检测：将分离并处理好的淋巴细胞及k562细胞分别以50：1和25：1的比例混合培养2 h。2 h后，在混合培养管中加入碘化丙啶(pi)对死亡的细胞进行染色，然后上机检测。
1.5 nk细胞比例检测
采用双标记直接免疫荧光流式细胞技术检测。抗凝血中加双荧光标记抗体fict-cd3和pe-cd56 cd16，经流式细胞仪分析，记数cd3-/cd56+cd16+ 细胞在所有淋巴细胞中的比例，即nk细胞比例。
1.6 统计学方法
ivig前后nk细胞毒性及nk细胞比例的改变采用配对t检验;治疗前后nk毒性改变与比例改变之间的相关性分析采用pearson相关系数进行相关性检验;各种检验均以p < 0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 一般情况
治疗组患者年龄平均30.4岁，入院时孕36.2 d，既往自然流产2.7次。对照组年龄平均30.7岁，入院时孕周35.9 d，既往自然流产2.6次。两组比较无统计学差异。
2.2 nk细胞毒性及比例的改变
ivig治疗后，研究组外周血nk细胞毒性、nk细胞比例较治疗前明显降低(50：1，p < 0.05;25：1，p < 0.05)。对照组间隔10天后，外周血nk细胞毒性、nk细胞比例较10天前无显著性差异(50：1， p > 0.05; 25：1， p > 0.05;表1、2)。
2.3 ivig治疗后nk细胞毒性改变与cd3-cd56+ cd16+ 细胞比例改变的相关性
研究组ivig治疗前后nk细胞毒性差值和cd3/cd16+ cd56细胞比例差值两组数据均服从正态分布，所以采用pearson相关系数进行相关性分析。分析结果见表3。 研究组ivig前后外周血nk细胞毒性改变与ivig前后cd3- cd56+ cd16+ 细胞比例改变没有明显的相关性(p > 0.05)。
3 讨 论
3.1 ivig治疗对外周血nk细胞的影响
尽管ivig治疗的确切机制还没有被完全阐明，但是对淋巴细胞反应和细胞因子产物的平衡调节应该是ivig治疗免疫机制的核心[4]。本研究发现ivig治疗后外周血nk细胞毒性及比例明显降低。由此可推测，ivig对rsa患者外周血中nk细胞有降调节作用。nk细胞的表面抗原cd16为低亲和性iggfc受体(fcrrⅲ)[5]，rsa患者体内异常升高的自身抗体与靶细胞表面相应表位特异性结合后，可通过其fc段与nk细胞表面fcrrⅲ的结合，而使nk细胞对靶细胞产生定向非特异性杀伤作用，即抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc效应)。结合本研究结果推测，ivig治疗成功可能是：大量的免疫球蛋白进入机体，球蛋白的fc段与nk细胞的表面抗原cd16结合，部分阻断了病理状态下自身抗体的fc段与nk细胞结合，从而抑制了nk细胞的adcc效应，达到降低nk细胞毒性的效果。此外，有学者曾报道，ivig治疗有利于促使免疫系统th1细胞向th2细胞转化[6，8-9]。在正常妊娠过程中， th2细胞反应活性高于th1细胞活性[7]。而rsa患者体内，th1/th2细胞比例失调，th1细胞占主导地位[7]。th1相关的细胞因子，如 il-2、inf-γ、tnf-α、β在复发性流产患者体内是明显升高的[8]。th1相关因子可以诱导nk细胞增值活化，th1细胞占主导地位，其分泌的细胞因子也相应的升高，这样可部分解释rsa患者nk细胞毒性及比例都有所上升的现象[9]。因此，ivig对nk细胞的抑制作用可能也与th1细胞向th2细胞的转化，使可诱导nk细胞增殖活化的th1细胞相关因子减少有关。
3.2 免疫治疗过程中nk细胞毒性与比例的关系
如前所述，ivig治疗对nk细胞毒性及比例均有降调节作用，本研究针对免疫治疗前后这两项检测的改变进行相关性的统计学分析，结果显示：ivig治疗后，nk细胞毒性下降与nk细胞比例减少没有明显的相关性，提示：免疫治疗对rsa患者外周血nk细胞毒性的抑制及比例的抑制是独立的，相互间没有太大的影响。对于这一结果，我们认为可能是由于nk细胞各亚群细胞所占的比例不同造成的。nk细胞存在两类亚群，cd56+cd16- 细胞亚群，和cd56+ cd16+ 细胞亚群，cd16可以触发nk细胞的adcc效应，所以该类亚群对同种异体抗原具有杀伤作用。lachapelle等也发现cd16+ nk细胞较cd16- nk细胞持续显示较强的细胞毒性[10]。总的nk细胞中，cd56+ cd16+ 细胞所占比例升高时，nk细胞的毒性就会相应的升高，相反亦然。因此，即使nk细胞总数不变，若两种nk细胞亚群比例不同，其nk细胞毒性也是不同的。由此提示我们可以在以后的研究中进一步对nk细胞进行分型检测，这样可能会更准确的反应nk细胞的活性状态。
3.3 细胞毒性及比例检测的临床意义探讨
nk细胞在妊娠的免疫防御及免疫调节过程中发挥着重要作用。在rsa患者体内，nk细胞毒性及比例异常升高，而且与妊娠结局有着明显的相关性。本实验研究结果显示，ivig治疗对nk细胞产生了一定的抑制作用，支持ivig治疗rsa有效的观点。关于ivig的治疗剂量、治疗持续时间以及是否需再次治疗及治疗间隔时间目前尚处于摸索阶段，国内外尚没有一个统一的标准。而且，rsa患者体内的免疫状态存在着较大的个体差异性，所以免疫治疗的间隔时间、持续时间，以及剂量等应个体化调整。因此，经ivig治疗后nk细胞毒性及比例降低，这提示我们可以考虑通过监测nk细胞毒性及比例的变化，结合其他免疫学指标来动态观察患者体内的免疫状态，指导临床免疫治疗方案的具体应用。本研究还发现免疫治疗后，nk细胞毒性改变与比例的改变两者没有相关性，由此提示：临床上两项指标的检测不能相互取代，应全面考虑两方面的改变。
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