作者：陈慧 陈立斌 宋小侠 谭剑平 孟丽丽 王蕴慧 张睿 刘颖琳 张建平
【摘要】 【目的】 探讨不明原因复发性流产(ursa)患者处于难免流产和流产后非孕状态等不同临床情况时外周血免疫细胞特征及其临床意义。 【方法】 回顾性分析2008-2010年于我院诊疗的自然流产患者184例，就诊时为早期妊娠难免流产的ursa患者55例(ursa难免流产组)，同期早期妊娠难免流产的偶发流产患者(sporadic abortion， sa) 23例，作为对照(sa难免流产组)。此外，就诊时为未孕状态，距最后一次流产3个月以上ursa患者62例(ursa非孕组)，同期未孕状态，距流产3个月以上sa患者44例作为对照(sa非孕组)。记录患者一般情况，包括年龄、月经周期。使用流式细胞术检测外周血免疫细胞，包括t淋巴细胞亚群：t细胞比例、th细胞比例、ts细胞比例、th/ts;其他免疫细胞：白细胞数量、淋巴细胞总数量(lym细胞)、b细胞比例、自然杀伤细胞(nk细胞)比例。【结果】 难免流产状态：ursa患者与sa患者th/ts均异常升高，前者为2.77 ± 5.16，后者为3.67 ± 6.12，ursa患者与sa患者比较，前者nk细胞比例明显升高，为(15.57 ± 6.45)%，后者仅为(11.38 ± 3.66)%，差异有统计学意义(p < 0.05)。wWW.11665.CoM非孕状态：ursa患者与sa患者比较，ursa患者wbc数量及nk细胞比例高于sa组，前者为(6.27 ± 1.09) × 109、(18.26 ± 7.88)%，后者为(5.59 ± 1.16) × 109、(11.0 ± 6.8)%，差异有统计学意义(p < 0.05)。 【结论】 在发生早期妊娠难免流产时，ursa患者与sa患者均存在一定的免疫紊乱，共同的表现是特异性免疫方面均有th/ts异常升高，不同的表现是，ursa患者在非特异性免疫方面存在nk细胞比例增高。在非孕状态，sa患者免疫紊乱得到调整回复正常，ursa患者仍然存在一定的免疫紊乱，主要表现在非特异性免疫方面，以wbc数量和nk细胞比例增高为主。临床工作中应注意监测ursa患者的免疫状态。
【关键词】 复发性流产; 妊娠; 免疫耐受; 免疫细胞; 难免流产
abstract： 【objective】 to investigate the clinical features of peripheral blood immune cells in unexplained recurrent spontaneous abortion (ursa) patients when the patients are in the state of inevitable abortion or non-pregnancy， and to provide clinical basis for ursa prevention and treatment. 【methods】 a retrospective analysis of 184 cases of ursa and the spontaneous abortion (sa) patients was conducted， and all patients were divided into 4 groups. ursa inevitable abortion group including 55 cases inevitable abortion in early pregnancy， while 23 cases in sa inevitable abortion group. in addition， 62 cases in the ursa non-pregnant group， while 44 cases in the sa non-pregnant group， the visiting time of the ursa non-pregnant group and the sa non-pregnant group were more than 3 months from last abortion. records of general situation of all the patients are made including age and menstrual cycle. the peripheral blood immunocytes were tested by using flow cytometry， including t cell ratio， th cell ratio， ts cell ratio， th/ts， the number of white blood cells (wbc)， the number of total lymphocytes (lym cells)， b cell ratio， and 妊娠时母体免疫系统对胚胎表现出免疫营养和免疫防护而非免疫攻击，一旦这种免疫耐受遭到破坏，可导致病理妊娠的发生[1]。在各种病理妊娠中，复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion， rsa)是颇为重要的一个，rsa指连续遭受2次或2次以上在妊娠20周前的妊娠产物或胎儿(体质量 < 500 g)丢失[2]。据统计，其发病率在5%左右[3-4]。rsa意味着不断发生的妊娠失败，在生理和心理方面对育龄妇女产生诸多不良影响，故rsa的诊疗成为生殖学研究热点。引起rsa发病的因素较多，除子宫畸形、内分泌因素和遗传因素及感染致胎儿畸形等，仍有60% ～ 70%患者病因不明，即原因不明复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion， ursa)，现认为大多数ursa与免疫异常有关。本研究旨在观察ursa患者在难免流产与非孕时的免疫状态，并与偶发流产患者(sporadic abortion， sa)进行比较，为ursa的防治提供依据。
1 材料和方法
1.1 分 组
1.1.1 ursa难免流产组
2008年至2010年就诊于我院的ursa难免流产患者55例，本次早期妊娠流产时间为孕6 ～ 10周，符合以下条件：①连续发生2次及2次以上的早期自然流产;②夫妇双方染色体核型正常;③盆腔b超、宫腔镜排除生殖道器质性病变;④宫颈分泌物检查沙眼衣原体、解脉支原体排除生殖道感染;⑤生殖内分泌激素测定无异常，无内分泌疾病史;⑥抗磷脂抗体、抗核抗体等自身免疫抗体阴性;⑦男方精液常规检查正常;⑧就诊时为早期妊娠，有腹痛或阴道流血症状，经检查阴道彩超证实为胚胎停育、难免流产;⑨近3个月未使用免疫药物或免疫治疗。
1.1.2 sa难免流产组
2008年至2010年就诊于我院，既往无自然流产病史，就诊时难免流产患者23例，此次就诊时为早期妊娠孕6 ～ 12周，有腹痛或阴道流血症状，经检查阴道彩超证实胚胎停育、难免流产。既往无内分泌疾病、免疫疾病史。行盆腔b超、宫颈分泌物检查沙眼衣原体、解脉支原体、生殖内分泌激素、男方精液常规检查正常。
1.1.3 ursa非孕组
2008年至2010年就诊于我院的ursa患者62例，符合以下条件：①连续发生2次及2次以上的早期自然流产;②夫妇双方染色体核型正常;③盆腔b超、宫腔镜排除生殖道器质性病变;④宫颈分泌物检查沙眼衣原体、解脉支原体排除生殖道感染;⑤生殖内分泌激素测定无异常，无内分泌疾病史;⑥抗磷脂抗体、抗核抗体等自身免疫抗体阴性;⑦男方精液常规检查正常或治疗后恢复正常;⑧封闭抗体阴性;⑨就诊时为非妊娠期，距最后一次流产3个月以上。
1.1.4 sa非孕组
2008年至2010年就诊于我院的sa患者44例(既往自然流产1次者)[5-7]。进行生殖保健咨询，无内分泌疾病、免疫疾病史，就诊时为非妊娠期，距流产3个月以上。行盆腔b超、宫颈分泌物检查沙眼衣原体、解脉支原体、生殖内分泌激素、男方精液常规检查正常。
1.2 临床处理
难免流产患者均予以清宫。
1.3 标本采集
ursa和sa难免流产患者，于清宫前抽取外周血3 ml，ursa和sa非孕患者，月经第5 ～ 8天抽取外周血3 ml，均送流式细胞仪室检测。
1.4 检测指标
t淋巴细胞亚群：t细胞比例、th细胞比例、ts细胞比例、th/ts(cd4+ t/cd8+ t)。其他免疫细胞：白细胞数量、淋巴细胞总数量(lym细胞)、b细胞比例、自然杀伤细胞(natural killer cell， nk细胞)比例。
1.5 检测方法
将各组静脉血3 ml，常规肝素抗凝后使用ficoll-hypaque法密度离心分离外周血单个核细胞。将细胞悬液使用cd45-fitc/cd56-rd1/cd19-edc/cd3-pc5、cd45-fitc/cd4-rd1/cd8-edc/cd3-pc5，通过孵育、透化等处理后，采用beckman coulter fc 500流式细胞仪，使用cell quest软件分选和计算t细胞亚群，包括t细胞比例、th细胞比例、ts细胞比例、th/ts(cd4+ t/cd8+ t)，以及白细胞数量、lym细胞数量、b细胞比例、nk细胞比例。
1.6 统计学方法
使用spss 13.0软件，计数资料以均数 ± 标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验或秩和检验。组内比较采取配对资料t检验或秩和检验。设p < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 一般情况
ursa非孕组月经周期短于sa非孕组，p < 0.05(表1、2)。
2.2 难免流产状态免疫细胞的比较
ursa患者与sa患者th/ts(cd4+ t/cd8+ t)均异常升高，前者为2.77 ± 5.16，后者为3.67 ± 6.12(判断标准为cd4+ t/cd8+ t < 1.0或 > 2.0)[6]。ursa患者与sa患者比较，前者nk细胞比例明显升高，为(15.57 ± 6.45)%，差异有统计学意义，p < 0.05(表3，图1、2)。
2.3 流产后非孕状态免疫细胞的比较
ursa患者与sa患者比较，t淋巴细胞亚群的各项指标表现为，ursa组th/ts(cd4+ t/cd8+t)高于偶发流产组，前者为6.72 ± 2.49，后者为2.16 ± 2.83，差异有统计学意义(p < 0.05);其他免疫细胞指标表现为，ursa患者wbc数量及nk细胞比例高于sa组，前者为(6.27 ± 1.09)%、(18.26 ± 7.88)%，后者为(5.59 ± 1.16)%、(11.00 ± 6.80)%，差异有统计学意义(p < 0.05，表4，图3、4)。
3 讨 论
近年，通过β-hcg检测等方法发现了部分生化妊娠、隐形流产，因此自然流产发生率约50% ～ 60%。在自然流产患者中，与同一性伴侣只发生过一次自然流产称为偶发性流产(sporadic abortion， sa)，发生率约11% ～ 13%，其原因多为遗传因素如胚胎染色体或基因异常等。如不进行检查治疗，有80%的患者能够再次妊娠并成功分娩，其原因在于再次妊娠重复发生遗传因素异常的可能性较小。
而复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion， rsa)的发生率因其定义不同而不同，近20年，伴随医学诊疗技术的发展以及对患者心理的研究，认为2次自然流产即需要予以积极的处理，因2次自然流产后，胚胎丢失风险明显加大，且流产次数越多，复发率越高。故将rsa定义为2次及其以上自然流产者。据此，rsa发生率为3% ～ 5%。rsa诊断治疗较为复杂，以往认为其病因为胚胎染色体异常(包括胚胎自身发育过程中出现的异常以及遗传自父母的异常)，女方解剖异常、内分泌异常、感染，然而以上所有因素仅能解释40%的自然流产，尚有60%患者原因不明，即ursa。经过近20年的发展，逐渐明确所谓ursa 80%以上都与免疫因素相关，免疫紊乱是导致流产的重要原因[8]。
本研究自然流产患者一般资料显示，ursa非孕组月经周期短于偶发流产非孕组，但仍在正常月经周期范围内，未达月经紊乱，该临床表现与本研究所设定的，ursa患者入选条件中生殖内分泌激素测定无异常相符。
本研究检测患者静脉血免疫细胞，发现在难免流产状态，均存在th/ts异常升高[9]。目前已知，t细胞按cd分子不同分为cd4+ 和cd8+，按功能可分为辅助性t细胞(th)和抑制性t细胞(ts)。本研究检测cd4+ th细胞和cd8+ ts细胞，前者介导细胞免疫， 其数量增多或功能亢进可使母体细胞免疫增强，对胚胎发生较强的免疫排斥反应， 导致妊娠不能继续。后者既可抑制由b 淋巴细胞介导的体液免疫，也可抑制cd4+ 细胞介导的迟发性超敏反应等，从而保证胚胎半同种抗原不被排斥，二者相互制约，达到平衡。有报道，cd4+ t/cd8+ t < 1.0或 > 2.0，即可视为免疫调节功能异常，而t细胞异常变化对ursa女性影响重大[10-12]。在流产后非孕状态，ursa组和sa患者th/ts(cd4+ /cd8+)均在正常范围。据此推测，自然流产发生后，机体免疫系统进行了一定的自我调整与平衡。
此外，ursa难免流产患者nk细胞比例高于sa难免流产组。nk是固有免疫系统中一类既不需要抗原刺激，又不需抗体参与即能杀伤某些靶细胞的非t非b类淋巴细胞。以往部分学者认为，蜕膜中nk细胞较外周血nk细胞更有意义，近来研究表明外周血中的nk细胞状况反映了子宫蜕膜中nk细胞的情况，检测外周血是较为安全、无创的方法。国外研究已经证实，在欧美人群中nk细胞异常与rsa相关[13-14]。目前，已知外周血cd56+ 细胞比例在正常人多为10% ～ 12%，本研究检测到ursa患者难免流产时高达15.57 ± 6.45%，在流产后非妊娠状态，ursa患者nk细胞比例亦高于sa组，提示ursa患者nk细胞比例增高可能是母体对胚胎的杀伤增强的表现，可能导致ursa的发生，因此nk细胞可作为检测ursa免疫状态的有效指标之一。
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