作者：李妍妍，杨笛，卞智萍，徐晋丹，陈相健，顾春荣，张寄南
【摘要】 目的： 克隆鼠抗人ctni mab fab段基因并进行序列 分析 . 方法 ：设计扩增鼠igg重链fd段及κ轻链引物，从分泌ctni mab的杂交瘤细胞中提取总rna，rtpcr扩增，对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析. 结果： 重链和轻链引物分别扩增出一约700 bp和800 bp dna片段. 经序列分析，与已发表的鼠igg基因序列对比，其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠igg1 fab段特征. 在genbank 登录，登录号为ay484430（重链）, ay484431（轻链）;氨基酸序列登录号为aar83243（重链）, aar83244（轻链）. 结论：本实验室获得了完整的鼠源性抗人ctni mab fab段基因，为鼠抗人ctni的人源化改造奠定了基础.
【关键词】 抗体，单克隆；基因；序列分析；血清心肌钙蛋白
【abstract】 aim: to obtain the gene of murine antictni fab fragment and analyse the nucleotide and deduced amino acid sequences. methods: by rtpcr method, the cdna of antictni murine antibody fab fragment was amplified from the hybridoma cells. cloning and subsequent sequence analysis of the fab fragment were performed. the deduced amino acid sequence was compared and analysed with previously published sequences. results: a band of approximate 700 and 800 base pairs was amplified using igg heavy chain primers and κ light chain primers, respectively. sequence analysis indicated that the deduced amino acid sequences were in consistent with the characterization of the amino acid present in the murine igg1 fab fragment (genbank accession no ay484430, ay484431; protein bank accession no aar83243, aar83244). conclusion: the cloning and sequencing of a complete murine antictni fab fragment provides a basis for the production of the chimeric antictni antibody.
【keywords】 antibody, monocolonal; genes; sequence analysis; cardiac troponin i
0 引言
本室已有多株高特异高表达的鼠源性抗人ctni细胞株，用来检测心肌损伤时外周血中ctni水平高低，显示了较高的临床诊断价值［1-4］. 但由于鼠源性mab的人抗鼠抗体反应［5］，使之不能用于体内诊断及作为 治疗 心肌损伤的药物载体，所以必须对其进行人源化修饰，有关鼠源性抗人ctni的人源化改造少见报道. 本 研究 目的是将鼠源性抗ctni抗体fab段基因克隆出来并进行序列分析，为下一步制备嵌合抗体打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料 杂交瘤细胞株1株（js200202），大肠杆菌e.coli dh5α由本室保存. pmd18t载体购自takara公司. taq dna聚合酶，amv逆转录酶（promega公司）； iptg(异丙基βd半乳糖苷)，xgal(5溴4氯3吲哚半乳糖苷)为上海生物工程公司产品. 质粒小量抽提试剂盒为上海华舜生物工程公司产品，g03sl离心式高纯质粒大量抽提试剂盒为上海申能博彩生物 科技 有限公司产品.
1．2 方法
1．2．1 pcr引物设计 根据已发表的小鼠fab段的fd基因和轻链基因、fr1和第一恒定区3′端的保守的基因序列，设计扩增fd基因和轻链基因的5′端和3′端引物. 重链fd段5′端引物：h1: 5′sak gtg cag ctc gag sag tca gga cct3′；h2: 5′gag gty cag ctc gaa car tct gga cct3′；h3: 5′cag gtc caa ctc gag cag yct ggg kct3′；h4: 5′gag gtt cag ctc gag cag tct ggr gcwg3′；h5: 5′gar gtg aag ctc gaa gag wct gga sga3′；h6: 5′gag gtg aag ctt ctc gac tct gga ggt3′；h7: 5′gaa gtg mag ctc gag gag tct ggg gga3′；轻链基因的5′端引物1：5′cct cta gag aca tcc aga tga mcc agt ctc c3′；2：5′cct cta gag aca tyk tgc tga cyc art ctc c3′；3：5′cct cta gar aca ttg tra tga cmc art ctc c3′；4：5′cct cta gag aca tyc agm tga cyc agt ctc c3′；5：5′cct cta gag gag aca ttg tga tga ccc agt c3′；6：5′cct cta gag ata ttg tgm taa cyc agk mts mas yc3′；7：5′cct cta gag ata tcs wka tga cmc agw ctm c3′；8：5′cct cta gag ctg ttg tgr tga cyc aaa ctc c3′；9：5′cct cta gag atg ttk tga tga ccc ama ctc c3′；10：5′cct cta gag atg ttt tga tga mcc aaa ytc c3′；11：5′cct cta gag ara ats tgc tca ccc agt ctc c3′；12：5′cct cta gas aaa ttg ttc tca ccc agt ctc c3′；13：5′cct cta gac agg ctg ttg tga ctc agg aat c3′;重链fd段3′端引物 igg1：5′agg ctt act agt aca atc cct ggg cac aat3′;igg2b：5′ctc cttactagtaggacaggggttgattgt3′;igg3：5′ggg ggt act agt ctt ggg tat tct agg ctc3′;轻链基因3′端引物： 5′gcg ccg tct aga att aac act cat tcc tgt tgaa3′. 以上s=c/g，y=c/t，m=a/c，w=a/t，k=t/g，r=a/g，由takara公司合成.
1．2．2 细胞总rna提取 从生长良好、能分泌mab ctni的杂交瘤细胞中，用异硫氰酸胍法从5×107杂交瘤细胞中提取总rna.
1．2．3 rtpcr扩增及其产物克隆 以oligo dt9为引物逆转录合成cdna. 以合成的cdna为模板，用上述上下游引物分别两两配对，进行pcr，扩增出fab段的重、轻链基因片段. 重链fd段pcr反应条件为：94℃变性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，35个循环，最后72℃延伸5 min；轻链反应条件为：94℃预变性10 min, 94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min. 回收扩增的fd和轻链基因，分别插入pmd18t载体中，取t载体0.5 μl，回收的fd或轻链基因4.5 μl，ligation solution 15 μl，总反应体积10 μl，16℃过夜反应. 取4 μl连接反应液转化e.coli dh5α菌［6］. 利用蓝、白斑筛选，菌落pcr鉴定重组质粒.
1．2．4 菌落pcr鉴定目的基因片段插入 引物序列为t载体的测序引物：上游引物（sequencing primer rvm）：5′gagcg gataa caatt tcaca cagg3′，下游引物（sequencing primer m1347）：5′cgcca gggtt ttccc agtca cgac3′，pcr反应条件为：94℃预变性10 min，94℃变性1 min, 52℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后72℃延伸10 min. 取10 μl的反应体积以13 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物. 电泳照片经 计算 机图像分析软件quantity one处理.
1．2．5 dna序列测定与分析 将dna样品及抽提的重组质粒送大连宝生物制品有限公司，经ab1310全自动测序仪进行序列测定. 用dnaman和blast软件分析所测序列.
2 结果
2．1 rna提取和rtpcr扩增的目的基因片段及测序 从分泌mab ctni抗体的杂交瘤细胞系js200202中提取总rna，紫外分光光度计a260 nm/a280 nm>1.9, 说明提取的rna纯度很高. h1,h4,h5,h7上游引物与下游引物igg1扩增出800 bp左右片段；h3扩增出400 bp左右片段；h2,h6未见片段扩出（图1）. 下游引物igg2b，igg3与所有上游引物配对均未见片段扩出. 测序报告证实h1，h4，h5，h7引物扩增的重链fd段基因具有同源性. 图2, 3为轻链pcr扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明l13引物扩增出700 bp左右片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段.
m：dl2000 marker;1～7∶1～7对上游引物扩增的重链pcr产物.
图1 重链fd琼脂糖凝胶电泳（略）
m：dl2000 marker;1～5∶1～5对上游引物扩增的重链pcr产物.
图2 1～5对上游引物扩增的轻链pcr产物电泳（略）
2.2 转化感受态细菌 选取h1和l13的pcr产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为1∶1，白色菌落均有20余个，对重链、轻链分别挑取16个菌落.
2．3 菌落pcr电泳 可见重链800 bp左右的片段，可见轻链700 bp左右的片段（图4，5），证明有目的片段插入t载体中. 用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来，送至takara公司测序.
2.4 重组质粒的插入片段测序报告［7-9］ genbank 登录号分别为ay484430，ay484431.轻链第23位和第93位亦为骨架区的两个半胱氨酸（cys）. 上述获得的抗体fab段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人ctni 单抗基因, 为igg1亚型. 网上核对v base数据库，重链可变区属于vh3家族，j段来源于jh3a，轻链可变区属于vkⅱ亚类（subgroupⅱ），j段来源于jk2.
m：dl2000 marker；1～8∶6～13对上游引物扩增的轻链pcr产物.
图3 6～13对上游引物扩增的轻链pcr产物电泳（略）
m：dl2000 marker;1，6，8，9：未插入重链fd段的pcr产物；2～5，7：插入重链fd段的pcr产物.
图4 重链片段的菌落pcr琼脂糖凝胶电泳（略）
m：dl2000 marker;1～4，6～13，15，16：插入轻链片段的pcr产物；5，14：未插入轻链片段的pcr产物.
图5 轻链片段的菌落pcr琼脂糖凝胶电泳（略）
3 讨论
由于本实验室已有能分泌mab ctni的杂交瘤细胞系，因此，我们首先合成若干对通用引物，用rtpcr技术，将抗ctni抗体的fab段基因扩增出来，测序，经internet网(网址：/kaoshiruanjian/" target="_blank" title="">软件 分析 ，得到氨基酸序列的编码框，中间都没有中止密码. 目前 国内外尚未见抗ctni抗体基因序列相关报道. 在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录，登录号分别为ay484430，ay484431. 抗人ctni抗体的fab段基因的克隆及序列分析为抗人ctni嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础.
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