【摘要】 目的：探讨抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（trail）的死亡受体5（dr5）单抗ym366ec引起jurkat细胞凋亡信号传导通路，阐明抗dr5抗体的抗肿瘤效应机制，为相关肿瘤治疗提供依据。方法：光镜下观察交联366ec作用下jurkat细胞形态变化，并利用mtt法检测jurkat细胞的增殖，利用fitcannexin v及pi标记流式细胞仪检测交联ym366ec对jurkat细胞凋亡率影响。进一步用western blot法检测交联ym366ec作用于jurkat细胞2、4、6、8、10、12小时时bcl2、cytc、bax、caspase3、caspase9的表达变化。结果：dr5抗体ym366ec单独应用无凋亡作用，但应用抗小鼠igg交联366ec后可致jurkat细胞染色质边集、断裂，细胞出芽，凋亡小体形成，并可直接诱导trail敏感的jurkat细胞凋亡改变。western blot检测到随着抗体诱导时间的延长jurkat细胞bcl 2蛋白表达减少；cytc、bax、有活性的caspase3和caspase9蛋白的表达增加。结论：交联抗dr5抗体ym366ec对jurkat细胞增殖有明显的抑制作用，诱导的jurkat细胞凋亡的分子机制涉及到cytc、bax、caspase3、caspase9。
【关键词】 交联 jurkat细胞 抗dr5抗体 凋亡 流式细胞术 免疫印迹
the study on the apoptosis mechanism of the jurkat cell induced by cross linking antidr5 antibodyym366ec
bai huiling，du yaowu，wang xueyin，li shulian，wang jing，liu guangchao，ma yuanfang.
research institute of immunology henan university, laboratory of cell and molecule immunology, henan university，kaifeng 475004, china
［abstract］objective:to detect the effect of crosslinking antidr5 ym366ec antibody on the jurkat cells, and to elucidate the anti tumour mechanism of antidr5 antibody.methods:morphologic changes of jurkat cells were observed by a microscope；cytotoxic and apoptotic effects of crosslinking antidr5 to jurkat cells were detected by mtt and fcm assays.bcl2,cytc,caspase3,bax and caspase9 were detected with western blot.results:chromatin aggregation,budding and apoptotic bodies were seen in jurkat cells treated by crosslinking antidr5 antibody;viability of jurkat cells was decreased and apoptosis increased obviously.expression of bcl2,cytc,caspase3,bax and caspase9 were detected, and they were changed with time of crosslinking antidr5 antibody treated.conclusion:apoptosis of jurkat cell can be induced by the crosslinking antidr5 antibody, and the apoptosis signal pathway may be relevant to cytc,caspase3,bax and caspase9.
［key words］ crosslink；jurkat cell；antidr5 antibody；apoptosis；flow cytometry；western blot
白血病是近年来比较高发的疾病，尤其在儿童人群中较为明显，并呈上升趋势。WWW.11665.cOM有关白血病治疗、发病机制的研究一直很受关注，目前已经取得了一定进展。肿瘤坏死因子（tnf）相关的凋亡诱导配体（tnfrelated apoptosis inducing ligand, trail）能够诱导多种肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡, trail诱导肿瘤细胞凋亡是通过其受体trailr1(death receptor4 dr4)及trailr2(death receptor5 dr5)介导的，但一些研究发现trail对正常肝细胞有毒性作用，限制了其临床应用［1，2］。一些抗trail死亡受体单抗具有死亡受体配体的功能活性，能模拟trail的作用，诱导肿瘤细胞凋亡，而且对人正常肝细胞等没有毒副作用［3，4］。本实验室利用人dr5蛋白免疫balb/c小鼠，制备出抗dr5的单克隆抗体，命名为ym366ec，我们研究发现该抗体交联后对jurkat细胞的增殖有明显的抑制作用，可以明显诱导trail敏感的白血病细胞jurkat细胞凋亡，为此我们以jurkat细胞株为靶细胞，探讨了抗dr5抗体ym366ec的抗肿瘤效应机制，为进一步临床治疗白血病提供理论根据［57］。
1 材料与方法
1.1 抗体和细胞系
抗dr5单克隆抗体ym366ec为本实验室制备［5］；羊抗小鼠igg为华美公司产品，效价为单扩1∶32；抗bcl2、βactin多克隆抗体、抗细胞色素c、抗caspase3、抗caspase9、抗bax单抗为santa cruz公司产品；辣根过氧化酶（hrp）标记的抗鼠二抗和hrp标记的抗兔二抗购自华美公司；ecl显影试剂盒购自amershem pharmacia公司；pvdf膜购自milipore公司；jurkat细胞为trail敏感细胞，由美国宾夕法尼亚大学医学院病理与实验医学系陈有海教授惠赠，培养于2 mmol/l l谷氨酰胺、1.5 g/l碳酸氢钠、10 mmol/l hepes、1 mmol/l丙酮酸钠、10%fbs、100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的rpmi1640培养基，在37℃、5%co2饱和湿度的条件下培养，实验时取对数生长期细胞。
1.2 主要材料与试剂
细胞培养材料、胎牛血清、 四氮唑蓝（mtt）购自gibco公司；fitcannexinⅴ/pi试剂盒购自bd公司。
1.3 诱导jurkat细胞凋亡的形态观察
收集jurkat细胞，800 g离心10分钟，弃上清，加含10%fbs的rpmi1640培养液制备jurkat细胞悬液，细胞密度为5×105 ml-1，加入96孔板，100 μl/孔。加ym366ec 50 μl，终浓度为2.35 μg/ml，再加入1∶10稀释的羊抗小鼠igg 50 μl，混匀，总体积为200 μl/孔，置37℃、5%co2培养箱内孵育4小时。倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照，然后离心，收集细胞，用甲醇及乙醇混合液固定。固定细胞经hoechst 33258染色后，制成滴片，在荧光显微镜下观察细胞形态变化并拍照。
1.4 jurkat细胞增殖测定
取96孔平底型细胞培养板，分对照组、ym366ec处理组、交联ym366ec处理组，每组设3个复孔。对照组只加20%fbs的1640培养基100 μl/孔。交联ym366ec处理组加含20%fbs的rpmi1640培养基100 μl/孔，加入dr5抗体ym366ec 50 μl，终浓度为2.35 μg/ml，再加入1∶10稀释的羊抗小鼠igg 50 μl，至第1孔，然后连续作10倍稀释。ym366ec处理组只加dr5抗体ym366ec，终浓度为2.35 μg/ml，连续作10倍稀释。然后每孔加jurkat细胞悬液100 μl，细胞数为1×104/孔，置37℃、5%co2培养箱内孵育10小时。离心，弃培养液，加新培养液200 μl/孔，加mtt（5 mg/ml）20 μl/孔, 置37℃、5%co2培养箱内孵育4小时。离心，弃上清，加150 μl/孔dmso，混匀，全自动酶标仪测od570值。实验重复3次，设取平均值，计算jurkat细胞存活率。
1.5 jurkat细胞凋亡测定
用rpmi1640培养液将jurkat细胞调成3×105 ml-1浓度接种于24孔板中，每孔加入1 ml细胞悬液，每种细胞分成5组（表1），每组设3个复孔，然后分别加入抗dr5抗体ym366ec（终浓度为2.35 μg/ml）、抗dr5抗体ym366ec（终浓度为2.35 μg/ml）+1∶10羊抗小鼠igg（终浓度为1∶40）、抗dr5抗体ym366ec（终浓度为0.235 μg/ml）+1∶100羊抗小鼠igg（终浓度为1∶400）、抗dr5抗体ym366ec（终浓度为0.023 5 μg/ml）+1∶1 000羊抗小鼠igg（终浓度为1∶4 000）、1∶100羊抗小鼠igg（终浓度为1∶400）。37℃、5%co2培养箱内孵育12小时，收集每孔细胞于小离心管中离心，用结合液洗1次，每孔细胞悬浮于100 μl结合液中，加fitcannexinⅴ溶液及pi染液各5 μl，混匀后避光室温放置15分钟，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。cellquest软件分析。表1 抗dr5抗体ym366ec交联对jurkat细胞的凋亡活性(略)
1.6 sdspage及western blot
用rpmi1640培养液将jurkat细胞调成3×105 ml-1浓度接种于24孔板中，每孔加入1 ml细胞悬液，第1孔加入抗dr5抗体ym366ec（终浓度为2.35 μg/ml）+1∶10羊抗小鼠igg（终浓度为1∶40），置37℃、5%co2培养箱内孵育2小时后，第2孔加入抗dr5抗体ym366ec和羊抗小鼠igg，剂量同前，孵育2小时后，第3孔加入抗dr5抗体ym366ec和1∶10羊抗小鼠igg，依次类推。12小时后分别收集每孔细胞，细胞经pbs清洗后，加入细胞裂解液裂解细胞，然后加入sds蛋白上样缓冲液混合煮沸10分钟后，按照文献［8］进行sdspage，其中浓缩胶5%，分离胶10%，电泳电压采用100 v。电泳结束后将样品转移到pvdf膜上，5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜，抗bcl2一抗室温作用1小时，tbst洗膜3次，每次7分钟，后加入辣根过氧化物酶标记的抗兔igg二抗，室温作用1小时，tbst洗膜3次，每次7分钟，然后在ecl反应液中显色1分钟，暗室压片显影。用βactin做内对照检测上样量的一致性。采取上述同样方法检测细胞色素c、caspase3、caspase9、bax蛋白的表达。
1.7 统计学处理
采用spss 13.0软件包进行处理，数据以x±s表示，比较采用成组方差分析，实验组和对照组采用dunnett检验。实验结果均被重复3次。
2 结果
2.1 交联抗体366ec作用于jurkat细胞4小时后，荧光染色显示
交联366ec作用后，细胞染色质浓缩，荧光强度增强，染色质边集，核破碎；而阴性对照细胞染色质疏松均匀，核着色均一，荧光相对弱，细胞大小一致，见图1。
2.2 抗dr5抗体ym366ec对jurkat细胞增殖的影响
在无抗小鼠igg交联的ym366ec处理jurkat细胞时，ym366ec对jurkat细胞无杀伤作用，而经抗小鼠igg交联后，ym366ec具有明显的杀伤作用，并且呈现明显的剂量相关性，见图2。
2.3 fitcannexin ⅴ及pi双染法流式细胞仪检测交联ym366ec对jurkat细胞的凋亡活性
交联ym366ec处理jurkat后细胞结合annexin ⅴ能力增强，提示磷脂酰丝氨酸在细胞膜表面表达明显增强。经交联后0.023 5 μg/ml ym366ec作用12小时，jurkat细胞的细胞凋亡率达13.25%，其中早期凋亡2.86%、晚期凋亡10.39%（图3b）；0.235 μg/ml的ym366ec作用12小时，jurkat细胞凋亡率达42%，其中早期凋亡23.85%、晚期凋亡 18.15%（图3c）；2.35 μg/ml的ym366ec作用12小时，jurkat细胞凋亡率达78.57%，其中早期凋亡35.99%、晚期凋亡42.58%（图3d）。
2.4 交联ym366ec诱导的jurkat细胞凋亡时信号传导系统的分子生物学变化
2.4.1 bcl2表达的变化
经2.35 μg/ml交联的ym366ec作用jurkat细胞不同时间的bcl2蛋白表达变化见图4，随着作用时间的延长bcl2蛋白表达逐渐下降。bcl2为抗凋亡因子，能够阻断线粒体膜间腔凋亡因子释放， 阻止线粒体释放cytc。
2.4.2 cytc、bax蛋白及活性caspase3、caspase9的表达变化
2.35 μg/ml交联的ym366ec作用jurkat细胞不同时间细胞色素c、bax蛋白表达增加，caspase3由前体procaspase3活化为具有活性的caspase3（20 000）、caspase9由前体procaspase9活化为具有活性的caspase9（35 000），并且随着时间的延长表达增加，见图4。
3 讨论
trail因能选择性的诱导肿瘤细胞凋亡而成为近年来研究的热点。trail通过与靶细胞表面的特异性受体结合而发挥作用。trail属于tnf超家族成员，trail有5种不同受体，其中dr4、dr5均含有死亡结构域，为死亡受体，与trail 特异性结合后可通过死亡结构域激发和传导凋亡信号, 诱导细胞凋亡, 是目前以死亡受体为靶点的肿瘤生物学治疗的研究热点，也具有广阔的应用前景。但trail的“诱骗受体”影响了trail诱导肿瘤细胞凋亡活性，trail的肝细胞毒性也限制了其临床应用［2］。研究发现一些抗死亡受体抗体能模拟trail的作用，诱导肿瘤细胞凋亡，寻找高效低毒的死亡受体的功能活性抗体为肿瘤生物治疗开辟了新方向。dr4与dr5均为死亡受体，但在37℃条件下trail与dr5的亲和力远大于dr4，而且多数肿瘤细胞主要表达dr5，正常细胞则表达很低或不表达［6，7，9］。硒、2甲基雌二醇、ifnα等能够提高dr5的表达水平，增加对trail的敏感性，抗白血病药物，如阿霉素等均能提高dr5的表达水平，增加其对trail的敏感性［10,11］。以上实验表明dr5是trail诱导肿瘤细胞凋亡的主要受体。
我们用含人dr5细胞外全长结构域重组dr5免疫balb/c小鼠，经细胞融合、筛选、纯化而获得一具有高亲和力的抗dr5单克隆抗体（ym366ec），其单独应用不能诱导肿瘤细胞凋亡［5］。经抗小鼠igg交联后应用流式细胞仪分析技术，观察到适宜比例剂量的交联可通过诱发凋亡而杀伤jurkat细胞（高表达dr5，并对trail高敏感），其凋亡作用与交联ym366ec的剂量和作用时间均有关系。为探讨ym366ec的抗肿瘤机制，我们利用免疫印迹检测了交联ym366ec作用于jurkat细胞不同时间信号传导分子的变化。
凋亡过程可分为启动、效应及降解三个阶段。磷脂酰丝氨酸从细胞膜内侧转移到外侧在细胞诱导凋亡不久发生，是凋亡的一个早期标志，因此annexinv/pi实验可以检测出早期凋亡细胞。线粒体在凋亡发生过程中具有中心地位。bcl2家族蛋白主要位于线粒体外膜，对凋亡过程的线粒体事件具有重要调节作用,其成员bax可促进凋亡，而bcl2则起抑制作用［12］。bcl2是在t（14，18）染色体易位断裂区克隆的一种原位癌基因,它通过抑制细胞凋亡而延长细胞存活时间。因此bcl2基因过度表达可以促进细胞生存，但不能通过刺激细胞分裂、增殖阻断细胞凋亡而延长细胞寿命［13］。bax是在线粒体外膜通过形成离子通道方式促进细胞色素c等蛋白分子释放，细胞色素c是胞核基因编码的蛋白质,当它转入线粒体后,形成带有亚铁血红素的细胞色素c称为全细胞色素c,可以诱导caspases激活。细胞损伤后,细胞色素c从线粒体释放,并与细胞凋亡激活因子1(apoptotic protease activating factor 1,apaf1,线虫ced4的同源物)结合,并活化caspase9前体,进而激活caspase3,引发caspases级联反应,从而诱发细胞凋亡［14，15］。
本实验采用annexinv/pi流式细胞术检测到交联ym366ec（2.35 μg/ml）作用12小时,jurkat细胞凋亡率达78.57%，其中早期凋亡35.99%，晚期凋亡 42.58%。western blot实验证明交联ym366ec（2.35 μg/ml）作用12小时,jurkat细胞bcl2减低已很显著，bax表达增加，从而改变了线粒体膜的通透性，cytc蛋白自线粒体渗入胞浆，激活caspase3前体，进入凋亡的降解阶段。我们的结果显示，交联ym366ec作用jurkat细胞凋亡时检测到了活性caspase3（20 000），因此交联ym366ec作用引起jurkat细胞凋亡需要caspase3的参与。
本实验结果证明交联ym366ec作用于jurkat细胞后，bax表达增加，增加了细胞膜的通透性，抗凋亡蛋白bcl2降低，线粒体cytc转位到胞浆，procaspase3降解而活化，发生水解作用，dna降解，导致jurkat细胞凋亡。
我们将进一步探讨抗dr5抗体诱导的jurkat凋亡的分子机制及和其他多种因子的联系以及抗dr5抗体与多种药物的联合使用，可为肿瘤的治疗提供新的思路和资料，也可更好的为临床治疗提供参考和帮助。
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