作者：李俐涛，张祥建，尹静，杨燚
【摘要】 目的: 探讨tlr4在脑出血大鼠血肿周围脑组织中的表达变化及其作用. 方法 ： 采用自体尾动脉血注入法制作脑出血大鼠模型，将50只sd大鼠随机分为假手术组、模型组，造模完毕后按不同时间点（术后6,24,48,72 h和7 d）随机分为5个亚组，每组5只. 各组于不同时间点取材，采用反转录多聚酶链反应(rtpcr)方法检测大鼠脑组织tlr4 mrna的相对表达. 结果： 各实验组各时间点tlr4 mrna均表达，假手术组tlr4 mrna的相对表达在各时间点无显著差异（p＞0.05）；模型组与假手术组相比tlr4 mrna相对表达显著升高(p＜0.05)，且在48 h达高峰,持续到72 h. 模型组相同时间点tlr4 mrna的相对表达与假手术组比较均明显增高，差异有统计学意义(p＜0.01）. 结论： 脑出血大鼠模型tlr4表达增高，提示tlr4在脑出血炎症损伤中可能具有一定作用.
【关键词】 脑出血；大鼠；toll样受体
【abstract】 aim： to explore the expression of toll like receptor 4 (tlr4) in brain tissue surrounding hematoma of cerebral hemorrhage rats and its role in brain inflammatory injury. methods: the cerebral hemorrhage models of rats were made by injecting autologous arterial blood collected from caudal artery. fifty male sd rats were randomly divided into 2 groups: sham operation and model groups. the expression of tlr4 mrna in the brain tissue surrounding hematoma was determined simultaneously by rt pcr. results: the expression of tlr4 gene in model group was higher evidently than that in sham operation group（p＜0.05). conclusion: the expression of tlr4 is increased in brain tissue surrounding hematoma of cerebral hemorrhage rats. it is indicated that tlr4 is increased in brain tissue surrounding hematoma of cerebral hemorrhage rats, which indicates that tlr4 might be involved in inflammatory reactions of intracerebral hemorrhage.
【keywords】 intracerebral hemorrhage; rat; toll like receptor
0 引言
脑血管病是临床常见病之一,尤其脑出血具有较高的发生率、致残率、病死率，其中一个很重要的原因是出血后水肿的形成和 发展 ，现已证明脑出血后的炎症反应是脑水肿的直接原因［1］. toll 样受体4 (toll like receptor 4, tlr4)在跨膜信号转导受体家族 tlrs中占有重要的位置［2］, 可介导细菌内毒素(lipopolysaccharide，lps)诱导的炎症反应. 研究 ［3-4］发现, tlr4 与心、肝、脑缺血性非生物性炎性损伤关系密切,但tlr4 是否也参与了脑出血非生物性炎性损伤尚不清楚,我们采用自体尾动脉血注入法建立大鼠脑出血模型，初步探讨tlr4在脑出血非生物炎性损伤中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 健康雄性sd大鼠 50只，体质量300 ～350 g，由河北医科大学基础医学院动物实验中心提供［许可证号dk0403007］，清洁级. narishige sr6n脑立体定向仪（日本）； 电子 天平(日本and hr120,精确度为0.1 mg)； rtpcr相关试剂(美国promeger公司)；所用引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；pcr扩增仪(德国eppendorf公司，572h)；低温离心机（德国eppendorf公司，5417r），凝胶成像 分析 系统(德国eppendorf公司，syngene).
1.2 方法
1.2.1模型制作 参照本实验室的方法进行［5］，即将动物用水合氯醛按35 mg/kg腹腔注射麻醉后，取尾动脉不抗凝血50 μl， 应用 脑立体定向技术注入大鼠脑内右侧尾壳核，术毕用医用骨蜡封闭针孔. 假手术组只进针不注血.
1.2.2动物分组 将大鼠随机分为脑出血组（25只）、假手术组（25只）. 造模完毕后按不同时间点随机分为5个亚组，即术后6,24,48,72 h和7 d,每组5只.
1.2.3 标本采集 于相应时间点断头处死动物，取血肿周围脑组织，称取100 mg，置于冰浴中的匀浆器并迅速匀浆，用于抽提总rna，剩余组织置于液氮中，-80℃保存.
1.2.4 血肿周围脑组织总 rna抽提与纯化 在冰浴匀浆器中加入1 ml trizol及100 mg组织，迅速研磨，将匀浆液装于 ep管中，加入200 μl氯仿剧烈震摇30 s，间隔放冰盒保温，反复震荡，4℃，12000 g，低温离心20 min，取上层水相转移至另一ep管中，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃过夜，4℃，12000 g，低温离心20 min，弃上清，加750 ml/l乙醇700 μl轻轻混匀，4℃，12000 g，低温离心10 min，轻轻吸出上清，室温垂直放置 20～30 min凉干，加入 depc水 20 μl溶解，留取 1 μl待测 rna浓度.
1.2.5 逆转录 (rt合成第 1条链 cdna) 在 pcr管中建立如下反应体系:依次加入如下试剂:5×rt buffer 5 μl，10 mmol/l dntp 2.5 μl，rnasin 1 μl，primer 1 μl， m mlv 1 μl，rna及depc 水总共14.5 μl. 短暂离心→振荡混匀→4℃低温短暂离心；在 pcr仪中, 37℃反转录 50 min,95℃ 5 min 灭活反转录酶，立即冰浴， -20℃保存.
1.2.6 聚合酶链式反应 (pcr) tlr4引物的设计 从genbank 中查到tlr4序列号为（#af057025），用gene toll软件设计 tlr4上游引物为5′ gcc gga aag tta ttg tgg tgg t 3′（2442-2463），下游引物为5′ atg ggt ttt agg cgc aga gtt t 3′，（2776-2795），pcr反应条件为预变性 95℃ 2 min后，变性95℃ 40 s，退火52℃ 40 s，延伸72℃ 1 min，35个循环后72℃延伸10 min，pcr产物为356 bp. 内参照β actin引物序列为:上游 5′ gcc atg tac gta gcc atc ca 3′；下游: 5′ gaa ccg ctc att gcc gat ag 3′, 扩 增 产 物 为375 bp. pcr反应条件:预变性 95℃ 2 min后，变性 95℃ 30 s，退火 52℃ 30 s，延伸 72℃ 40 s; 35个循环后，最后延伸 72℃ 5 min.
1.2.7 pcr 产物的电泳鉴定 将各样品pcr 产物5 μl（β actin 5 μl）加于20 g/l琼脂糖凝胶电泳槽齿孔中，取pcr标准同时电泳，作为标准分子量参照. 1×tbe 50 v恒压电泳 40～60 min,取胶置凝胶成像系统中，紫外光下拍照，结果扫入电脑备处理.
统计学处理：电泳条带密度值以（灰度 ×面积）/（参照物的灰度 ×面积）表示. 数据均以x±s表示，运用t 检验进行统计处理. 所有数据用 sas统计软件处理.
2 结果
两组各时间点tlr4 mrna/β actin mrna灰度比值表明：各时间点tlr4 mrna均表达，假手术组tlr4 mrna的相对表达在各时间点无显著差异（p＞0.05，表1，图1）；模型组与假手术组相比tlr4 mrna相对表达显著升高，且在48 h达高峰,持续到72 h. 各时间点tlr4 mrna的相对表达与假手术组比较均明显增高，差异有统计学意义（p＜0.01）.
表1 不同时间点大鼠脑组织tlr4 mrna水平的比较（略）
1，7：假手术； 2，8：术后6 h； 3，9：术后24 h； 4，10：术后48 h；5，11：术后72 h； 6，12：术后7 d； m: marker.
图1 不同时间点大鼠脑组织tlr4 mrna表达（略）
3 讨论
脑出血损伤见于许多临床病理过程， 影响 这一过程的因素是多方面的. 一般认为，脑出血损伤是典型的非感染性炎症，氧自由基的产生及炎症介质的释放是其重要机制. 近年认为tlr4在非感染性炎症损伤中起重要作［3-4］. tlrs属于i类跨膜受体,在tlrs家族中，tlr4的结构及其参与促炎反应、促进免疫细胞成熟分化及调节免疫应答等方面 研究 的较为清楚. 目前 已证实人和鼠脑内有众多的tlr4表达［6］，tlr4广泛分布脑室周围血管丛，小胶质细胞，星形胶质细胞，脑内血管平滑肌细胞和内皮细胞也表达tlr4 mrna. 内、外源性激活均可激活 tlr4,激活的 tlr4 招募胞内髓样分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88, myd88),将信号传至nfκb, 最终导致多种炎症因子的瀑链式释放而产生生物学效应. tlrs家族不仅识别外源性微生物，而且识别内源性有害物质［7］，如参与调节机体对坏死细胞、热休克蛋白、细胞外基质降解产物等的应答. 最近研究证实［8-9］tlr4在诱导的中枢神经损伤中发挥着关键作用，小胶质细胞是损伤介质的主要来源. tlr4作为炎性跨膜受体在感染性疾病研究领域中已是热点. 近年来，tlr4在非生物性炎症损伤中的作用引起了人们的关注. 脑出血后血肿周围的炎症损伤成为造成脑水肿的直接原因［1］，此点已被证实，脑出血后的炎症损伤是否与tlr4有关呢？
我们的实验中假手术组各时间点变化无差异，脑出血组6 h表达类似假手术组，但24,48,72 h和7 d tlr4 mrna则相对表达明显增多，于出血后48 h达高峰，并持续到72 h，由此可以推断，出血后损伤组织释放的内源性激活物被tlr4识别后，启动了tlr4的信号传导通路，并进一步激活nfκb而释放致炎细胞因子，造成组织损伤.
tlrs强烈激活会导致高水平炎性细胞因子的分泌，从而加重细胞的损伤［10］. 这说明tlr4信号传导途径在脑组织损伤所诱导的炎症反应中具有重要的作用. 总之,对 tlr4在脑出血炎症损伤中作用机制的进一步研究，将有助于阐明固有免疫的启动与机体基本应激反应性损伤之间的联系, 并可能从炎症反应起点控制的角度揭开炎症因子参与脑出血损伤发生 发展 的机制.
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