【摘要】 目的: 探讨分枝杆菌热休克蛋白（hsp70）对草原兔尾鼠卵透明带3（lzp3）免疫不育效果的增强作用。方法: 将hsp70全长和c端分别与lzp3融合构建pcd-l-hsp70和pcd-l-hsp70c重组质粒, 同时与具有免疫不育功能的pcd-l和pcd-aclc一起分别免疫nih小鼠, 分别检测重组质粒在机体真核细胞中的表达情况、 t细胞增殖及体液免疫水平、 抗生育效果、 卵巢的病理变化和免疫荧光定位。结果: lzp3构建的重组质粒均能在小鼠肝脏中表达; 免疫后能刺激机体t细胞增殖, 尤其是pcd-aclc和 pcd-l-hsp70c免疫组（p<0.01）; 同时激发机体产生特异性抗体（p<0.05）; 除pcd-l-hsp70免疫组外其他3种重组质粒均具有抗生育效果（p<0.05）, 且 pcd-aclc和pcd-l-hsp70c极明显地降低了小鼠平均窝仔数（p<0.01）且未引发机体产生卵巢炎; 直接免疫荧光结果表明在绿色激发光下小鼠卵母细胞的卵透明带均能发出绿色荧光。结论: 与pcd-l-hsp70免疫相比, pcd-l-hsp70c能明显地降低小鼠平均窝仔数, 这表明分枝杆菌热休克蛋白hsp70c端对增强lzp3免疫不育效果具有明显的基因佐剂功效。
【关键词】 草原兔尾鼠卵透明带3 免疫不育 hsp70 融合佐剂
immunocontraceptive effect of dna vaccines of lagurus lagurus zona pellucida 3 fusioned with c-terminal of hsp70
zhang yu, li yi-jie, ma zheng-hai, chen xuan, pan xiao-yan, zhang fu-chun*
xinjiang key laboratory of biological resources and genetic engineering, college of life science and technology, xinjiang university, urumqi 830046; academy of animal sciences of xinjiang urumqi 830000, china
［abstract］ aim: to investigate the immunocontraceptive effect of lagurus lagurus zona pellucida 3 gene (lzp3) fused by mycobacterium tuberculosis hsp70 and c-terminal of hsp70. methods: two immunocontractive recombinant plasmids pcd-l-hsp70 and pcd-l-hsp70c were constructed using lzp3. meanwhile, pcd-l and pcd-aclc which were effective immunocontraceptive vaccines were studied as control. results: after the lzp3 genes were expressed in the livers of mice with the introduction of hydrnamic transfection instead of traditional hela cell transfection by rt-pcr, nih mice were immunized with zp3 dna vaccines. the results of elisa showed that all of the recombinants in mice elicited specific anti-zp3 antibodies which were combined with the zp3 of oocytes from the immunized mice in immunofluorescence assay. mts assay showed that the lymphocytes in all groups were proliferated by stimulating the recombinant lzp3 with no disruption of follicular in ovaries, especially those in groups of pcd-aclc and pcd-l-hsp70c (p<0.01). antifertility experiments showed that three groups (besides pcd-l-hsp70) enhanced the sterile effects (p<0.05), especially those in the groups of pcd-aclc and pcd-l-hsp70c (p<0.01). conclusion: lzp3 fused by the c-terminal of mycobacterium tuberculosis heat shock protein hsp70 had a good immunocontraceptive effect while lzp3 fused by mycobacterium tuberculosis heat shock protein hsp70 had a poor effect on birth control. so the c-terminal of mycobacterium tuberculosis heat shock protein hsp70 might be a better candidate to deliver the adjuvant function in lzp3 dna immunocontraceptive vaccination than the complete hsp70 molecule.
［keywords］lagurus lagurus zona pellucida 3 (lzp3); antifertility; hsp70; fusioned adjuvant
哺乳动物的卵透明带（zona pellucida, zp）一般由zp1、 zp2和zp3（或zpa、 zpb、 zpc） 3种糖蛋白组成, 其中zp3含有精子初级受体, 是精卵结合过程中精子必须穿过的障碍。wWW.11665.Com大量研究表明, 阻断精子与zp3的结合就可以阻断小鼠、 猪等的生殖过程, 从而实现控制哺乳动物的种群和数量［1, 2］。因此zp3是利用免疫不育技术控制有害哺乳动物的理想靶抗原。热休克蛋白(hsp)是一些进化上非常保守的蛋白质家族分子, 其中hsp70家族是hsp中最大的一族, 能与相对分子质量(mr)差异很大的蛋白质和多肽结合, 直接作用于免疫系统上的hsp70受体, 很大程度提呈目的基因的表达产物［3］; 另一方面hsp70具有交叉提呈作用［4］, 将其与zp3融合可能会避免dna疫苗引发的自身免疫性卵巢炎。hsp70c 端具有刺激产生cc趋化因子、 il-12、 tnf-α、 no和促使dc细胞成熟及t细胞向th1型极化发展的作用, 是hsp70中真正行使佐剂功能的区域［5］。因此本研究中将草原兔尾鼠卵透明带3（lagurus lagurus zona pellucida 3, lzp3）基因与 hsp70及hsp70c 端序列分别融合、 构建dna疫苗pcd-l-hsp70 和pcd-l-hsp70c, 同时与具有免疫不育功效的重组dna疫苗pcd-l和pcd-aclc［2］分别免疫小鼠, 比较抗生育效果, 探究hsp70c端对免疫不育效果的影响, 为研制高效的dna不育疫苗奠定理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料 重组质粒pcdna3-lzp3（pcd-l）、 pcdna3-aat-comp-lzp3-c3d3（pcd-aclc）、 pcdna3- lzp3-hsp70（pcd-l-hsp70）和pcdna3-lzp3-hsp70（c）（pcd-l-hsp70c）由本实验室构建; 4~6周龄雌性nih小鼠购自新疆医科大学动物实验中心; 引物及相关测序均由北京奥科生物公司提供完成。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建、 鉴定及纯化 设计带有连接子（g-s-g-g-s）3的融合引物［6］ lzp3-hsp70(n) p1(n) 5′-aatgaattcatgtgtgccctgcctctgtg-3′; p2(n): 5′-aatggatccagaaccgccagatccagagccaccccagccctccacagcct-3′; p3(n): 5′-aatggatccggtggctctggatctgctcgtgcggtcgggatc-3′; lzp3-hsp70(c) p3(c): 5′aatggatccggtggctctggatctatccaggaaggctcgggc-3′; p4(c): 5′-aatctcgagtcacttggcctcccggcc-3′。pcr分别扩增lzp3、 hsp70和hsp70c端。用ecor i/bamh i酶切纯化的lzp3, bamh i/xho i酶切纯化的hsp70和hsp70c, 然后将其与ecor i/xho i酶切的pcdna3进行连接, 构建成重组质粒pcd-l-hsp70和pcd-l-hsp70c, pcr、 酶切和测序鉴定重组质粒正确性后用peg8000纯化质粒, hitachi uv3010检测质粒的纯度及含量, 然后用生理盐水调整质粒的终浓度至1 g/l。
1.2.2 重组质粒在体内真核细胞中的瞬时表达检测 按照水动力体内转染真核细胞学说［7］, 将溶有重组质粒的2.5 ml生理盐水, 快速注入小鼠尾静脉8 h后提取小鼠肝脏, rt-pcr检测目的基因的表达情况。
1.2.3 dna疫苗免疫 随机将实验小鼠分为7组, 每组9只, 于小鼠后腿胫骨前肌预免5 ml/l普鲁卡因100 μl, 24 h后在同一部位多点注射质粒dna 100 μl（质粒含量1 g/l）, 2周后免疫加强。加强前于小鼠眼眶静脉丛取血, 收集血清, -20℃备用。
1.2.4 t细胞增殖实验 采用常规的mts检测方法, 分别用cona、 bsa、 gst-lzp3刺激脾脏单细胞悬液（1×106）, 每组设3个重复。以刺激指数（si=各刺激组的a值/未加刺激物组a值）测定小鼠淋巴细胞的增殖能力。
1.2.5 免疫小鼠抗血清的elisa检测 采用间接elisa法, 以纯化gst-lzp3融合蛋白作为标准抗原蛋白, 以-20℃冻存血清作为一抗, 羊抗鼠igg作为二抗,酶标仪检测各孔a450/655值。
1.2.6 小鼠抗生育实验 将免疫80 d后的nih雌鼠与具有生育能力的未免疫雄鼠进行1∶1合笼, 第2天检测阴栓, 检测到的分笼喂养, 20~23 d后计算生仔数。
1.2.7 小鼠卵巢组织学检测 将鼠卵巢组织取出后用40 g/l多聚甲醛固定, 脱水透明, 石蜡包埋, 修块切片后做he染色, 与生理盐水、 pcdna3、 pcdna3-hsp70组作为对照进行分析比较。
1.2.8 小鼠卵母细胞的免疫荧光检测 将非发情期的实验鼠分别腹腔注射pmsg（10万u/只）, hcg（10万u/只）, 14~15 h后处死小鼠, 收集卵丘卵母细胞复合体（coc）。透明质酸酶消化后将单个成熟的卵母细胞置于载玻片上, 固定, 封闭, 以-20℃冻存的血清作为一抗, fitc标记的羊抗小鼠igg作为二抗, 甘油缓冲液封存后在倒置显微镜下观察、 照相。
2 结果
2.1 重组质粒的构建及鉴定 将真核表达载体pcdna3和另外5种重组质粒载体分别进行限制性内切酶酶切和pcr检测。电泳结果显示: pcd-l、 pcd-l-hsp70、 pcd-l-hsp70c和pcd-aclc的酶切和pcr均得到1100 bp左右的lzp3; pcd-hsp70和pcd-l-hsp70的酶切和pcr均得到1900 bp左右的hsp70全长; 而pcd-l-hsp70c的酶切和pcr则得到500 bp左右的hsp70c端; pcd-aclc经3种酶hind iii/xho i/xba i作用后还得到1条2700 bp左右的条带, 这是3分子的c3d。从酶切和pcr结果初步推测重组质粒构建正确, 测序结果再次证明重组质粒的正确性（图1）。
图1 重组质粒的酶切和pcr鉴定（略）
fig 1 restriction enzyme digestion analysis and pcr of recombinant plasmids
1: negative control of pcr; 2, 13, 16: dl 15000 marker; 3: pcdna3 pcdna3 digested by hind iii/xho i; 4: pcr of pcdna3; 5: pcdna3-lzp3 pcdna3 digested by hind iii/xho i; 6: pcr of pcdna3-lzp3; 7: pcdna3-hsp70 digested by hind iii/xho i; 8: pcr of pcdna3-hsp70; 9: pcdna3-lzp3-hsp70 digested by hind iii/bamh i/xho i; 10: pcr of pcdna3-lzp3-hsp70; 11: pcdna3-lzp3-hsp70(c) digested by hind iii/bamh i/xho i; 12: pcr of pcdna3-lzp3-hsp70(c); 14: pcr of pcdna3-aat-comp-lzp3-c3d3; 15: pcdna3-aat-comp-lzp3-c3d3 digested by hind iii/xho i/xba i.
2.2 重组质粒在机体真核细胞中表达的rt-pcr检测 提取小鼠肝脏总rna, 然后将其反转录的cdna作为模板, 用lzp3核心引物和hsp70引物分别扩增目的条带, 结果表明几种重组质粒均能在小鼠肝脏中瞬时表达, 这说明目的基因可以在真核细胞中进行mrna水平上的表达（图2）。
图2 水动力技术检测重组质粒在小鼠体内的真核表达（略）
fig 2 the results of plasmids rt-pcr with the hydrodynamics-based delivery in mouse liver cells
1: negative control of pcr; 2, 13: dl 2000 marker; 3: rt-pcr of pcdna3; 4: pcr of the whole rna of pcdna3; 5: rt-pcr of pcdna3-hsp70; 6: pcr of the whole rna of pcdna3-hsp70; 7: rt-pcr of pcdna3-lzp3; 8: pcr of the whole rna of pcdna3-lzp3; 9: rt-pcr of pcdna3-lzp3-hsp70; 10: pcr of the whole rna of pcdna3-lzp3-hsp70; 11: rt-pcr of pcdna3-lzp3-hsp70c; 12: pcr of the whole rna of pcdna3-lzp3-hsp70c; 14: rt-pcr of pcdna3-aat-comp-lzp3-c3d3; 15: pcr of the whole rna of pcdna3-aat-comp-lzp3-c3d3; 16: dl 15000+2000 marker.
2.3 dna疫苗免疫小鼠的t淋巴细胞增殖反应 淋巴细胞增殖刺激指数结果表明, 与对照相比, pcd-l、 pcd-l-hsp70、 pcd-l-hsp70c和pcd-aclc免疫组均能诱导很强的特异性淋巴细胞增殖反应, 其中pcd-l-hsp70c和pcd-aclc实验组的增殖效果有统计学意义（p<0.01）, 说明重组质粒在小鼠体内可以激发特异性的细胞免疫反应。
2.4 免疫血清中特异性抗体的elisa检测 elisa检测结果显示重组质粒免疫组在第1次免疫后血清中都出现了特异性抗体, 随着免疫次数的增加, 血清中抗体水平均呈上升趋势。与对照组pcdna3相比, 除pcd-l-hsp70组差异有统计学意义（p<0.05）外, 其他3组都极明显地提高特异性抗体水平（p<0.01）。
2.5 抗生育结果 spss软件分析抗生育结果表明: 和对照组相比, pcd-l、 pcd-l-hsp70、 pcd-l-hsp70c和pcd-aclc 4种重组质粒均能使雌性小鼠平均窝仔数下降, pcd-l免疫组的平均窝仔数明显减少（p<0.05）, pcd-l-hsp70c和pcd-aclc免疫组的平均窝仔数极明显地减少（p<0.01）, 但2组之间的平均窝仔数没有明显差异; 而pcd-l-hsp70免疫组的平均窝仔数减少不明显, 无统计学意义（p>0.05）。
2.6 小鼠卵巢组织病理学切片检测 小鼠卵巢组织石蜡切片经苏木素-伊红（he）染色后, 与正常小鼠和对照组小鼠卵巢结构相比: 免疫组小鼠卵巢结构无明显病理变化, 均存在各个发育阶段的卵母细胞, 黄体也未出现异常膨大及细胞内和细胞间的炎症反应现象（图3）。2.7 小鼠成熟卵母细胞的免疫荧光检测 将超排小鼠的成熟卵母细胞固定到载玻片上进行直接和间接免疫荧光检验, 结果发现: 无论是间接免疫荧光还是直接免疫荧光, 在绿色激发光下, 小鼠的卵透明带上均能被激发出绿色荧光（图4）。
3 讨论
在dna疫苗的发展进程中, 选择合适的佐剂与选择目的基因本身同样重要, 本研究中我们将hsp70与抗生育基因lzp3融合探讨其对免疫不育效果的影响。hsp70是一种很好的广谱免疫佐剂, 然而一些研究表明hsp70存在一定的局限性, 相比之下hsp70c端具有更好的免疫佐剂功能。葛菲菲等［8］发现融合hsp70全长虽使il-2的水平及t细胞增殖有所提高和增强, 但效果远不及融合hsp70c端免疫组明显, 推测可能是由于抗原提呈细胞(apc)表面受体与hsp70结合区域集中在肽连接区, 而atp酶区有抑制il-10和tgf-α产生的作用, 且hsp70会掩盖某些抗原表位, 从而降低了hsp70全长载体分子效应, 而hsp70肽连接区则体现了明显的佐剂优势［9］。随后, li等［10］同样发现融合hsp70c端(359~610)的dna疫苗不仅能明显地提高hbsag的特异性ctl水平, 而且能够克服ld限制性抗原决定簇所造成的抑制作用, 同时还可高效清除机体循环系统中的hbsag, 大大下调hbv的复制, 而融合hsp70n端及全长的dna疫苗却无此功用, 认为这也与hsp70359~610具有th1样细胞因子和cc趋化因子功能有关。cardozo等［11］进一步表明hsp70c端能和蛋白酶体作用形成一个指环样的“u”型结构, 这种由十肽重复序列组成的结构广泛存在于泛素连接酶中, 它可使hsp70c 端融合的目的基因被精确降解, 进而被胞吞和高效提呈。基于上述原因, 本研究采用15个小分子氨基酸即（g-s-g-g-s）3作为连接子将不育基因（lzp3）和hsp70c端进行融合表达, 为hsp70c和lzp3目的蛋白的正确折叠提供更为广阔充分的三维空间结构来增强免疫效果［9］。结果表明pcd-l-hsp70c免疫组与pcd-l-hsp70相比极明显地激发机体产生特异性的lzp3抗体水平和t细胞增殖能力, 表明hsp70c端功能相对不明区对增强lzp3的免疫不育具有佐剂增强的生物学功能, 且极明显地降低小鼠平均窝仔数, 实现了预期避免机体卵巢炎发生的目的, 为筛选高效安全的dna不育疫苗控制草原兔尾鼠免疫不育的研究和应用提供了可靠的理论基础。
图3 免疫小鼠卵巢组织病理切片检测 （略）
fig 3 histology of 4 μm ovarian sections from dna vaccines immunized mice
a: non-immunized mice; b: mice intramuscularly immunized with 90 ml/l saline; c: mice intramuscularly immunized with pcdna3.0; d: mice intramuscularly immunized with pcdna3-hsp70; e: mice orally immunized with pcdna3-lzp3; f: mice orally immunized with pcdna3-lzp3-hsp70; g: mice orally immunized with pcdna3-lzp3-hsp70c; h: mice orally immunized with pcdna3-aat-comp-lzp3-c3d3.
图4 小鼠卵母细胞的直接和间接免疫荧光检测（略）
fig 4 immunofluorescence detection of direction and indirection of oocytes
a: detection of oocytes from control mice in transfer light（×100）; b: direction immunofluorescence detection of oocytes from control mice（×100）; c: detection of oocytes from mice immunised by pcdna3-lzp3-hsp70 in transfer light（×200）; d: direction immunofluorescence detection of oocytes from mice immunised by pcdna3-lzp3-hsp70（×200）; e: detection of oocytes from control mice in transfer light（×100）; f: indirection immunofluorescence detection of oocytes from control mice（×100）; g: detection of oocytes from pcdna3-lzp3-hsp70(c) mice in transfer light（×100）; h: direction immunofluorescence detection of oocytes from pcdna3-lzp3-hsp70c mice（×100）.
【参考文献】
［1］ li x, shi sq, yang y, et al. immunogenicity of four complementary deoxyribonucleic acid fragments from rabbit zona pellucida 3 and their effects on fertility［j］. fertility and sterility, 2007, 87(2): 381-390.
［2］ 王焱冰, 李轶杰, 张富春. 分子佐剂c3d增强草原兔尾鼠卵透明带3 dna疫苗的免疫应答［j］. 分子细胞生物学报, 2006, 39(4): 297-303.
［3］ srivastava pk, amato rj. heat shock proteins: the ‘swiss army knife’ vaccines against cancers and infectious agents［j］. vaccine, 2001, 19(17-19): 2590-2597.
［4］ qazia kr, wikmanb m, vasconcelosa nm, et al. enhancement of dna vaccine potency by linkage of plasmodium falciparum malarial antigen gene fused with a fragment of hsp70 gene［j］. vaccine, 2005, 23(3): 1114-1125.
［5］ wang y, kelly cg, singh m, et al. stimulation of th1-polarizing cytokines, c-c chemokines, maturation of dendritic cells and adjuvant function by the peptide binding fragment of heat shock protein 70［j］. j immunol, 2002, 169(5): 2422-2429.
［6］ 孙强明, 戴长柏, 李亮助, 等. 四种hgm-csf/il-6融合蛋白的基因构建、 表达及活性比较［j］. 中华微生物和免疫学杂志, 2004, 24（2）: 128-133.
［7］ liu f, song yk, liu d. hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid dna［j］. gene ther, 1999, 6(7): 1258-1266.
［8］ 葛菲菲, 邱亚峰, 杨耀武, 等. 乙脑病毒e-hsp70与e-肽连接区对小鼠特异性免疫的比较［j］. 中国病毒学, 2005, 20(4): 357-361.
［9］ wendling ul, paul r, van der z, et al. a conserved mycobacterial heat shock protein(hsp)70 sequence prevents adjuvant arthritis upon nasal administration and induces il-10-producing t cells that crossreact with the mammalian self-hsp70 homologue［j］. j immunol, 2000, 164(5): 2711-2717.
［10］ li xm, yang xf, li lw, et al. a truncated c-terminal fragment of mycobacterium tuberculosis hsp70 gene enhanced potency of hbv dna vaccine［j］. vaccine, 2006, 24(16): 3321-3331.
