作者：曾建涛，王继红，黄家利，程梅
【摘要】 目的： 研究 葡萄糖对l02细胞肝x受体(lxrα)与血管生成素样蛋白3(angptl3)基因表达的 影响 ，探讨lxrα在糖尿病和脂代谢联系中的作用. 方法 ： 用5.6, 7.0, 11.1, 28.0和33.0 mmol/l的葡萄糖培养l02细胞，5.6 mmol/l组作为对照组.用胆固醇酶联法测定各组细胞内胆固醇含量，采用rtpcr方法检测lxrα和angptl3的mrna表达量. 结果： 高浓度葡萄糖可促进l02细胞内胆固醇含量上调lxrα和angptl3 mrna表达，变化差异均有统计学意义(p<0.05). 结论： 高浓度葡萄糖增加angptl3表达，可能是通过增加细胞内总胆固醇含量而激活lxrα，而lxrα的激活则引起angptl3基因的高表达.
【关键词】 血管生成素样蛋白3；肝x受体α； 糖尿病
【abstract】 aim: to investigate the effects of glucose on expressions of lxrα and angptl3 in l02 cell, and to explore the relation of lxrα with the development of diabetes mellitus accompanied with hyperlipoproteinemia. methods: l02 cells were cultured separately in mediums containing 5.6, 7.0, 11.1, 28.0 and 33.0 mmol/l glucose, among which 5.6 mmol/l glucose group was taken as control. quantitative analysis of intracellular cholesterol content was performed by cholesterol enzyme link assays. the lxrα and angptl3 mrna were determined by reverse trancriptase polymerase chain reaction (rtpcr). results: the expression of lxrα and angptl3 mrna increased with the increase of the glucose concentration. the levels had significant difference (p<0.05). the contents of total cholesterol also increased significantly in l02 cell, and had significant difference (p<0.05). conclusion: glucose may interfere angptl3 mrna through incresasing total cholesterol, activating lxrα. the activation of lxrα upregulates the expression of angptl3.
【keywords】 angiopoietinlike protein 3; lxrα; diabetes mellitus
0 引言
肝x受体（liver xactivated receptor, lxrs）是核受体超家族的成员，包括两种同源亚型lxrα(nr1h3)和lxrβ（nr1h2）. lxrs作为甾醇类感受器调节一系列与脂质代谢相关基因的表达. 血管生成素样蛋白3（angiopoietinlike protein 3, angptl3）是新的lxrs靶基因，在脂质代谢中有重要作用［1-2］. 本研究以人肝细胞株l02为研究对象，从细胞水平研究葡萄糖对lxrα和angptl3基因表达的影响，探讨lxrα在糖尿病和脂代谢联系中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝细胞株l02（重庆医科大学基础医学研究所）；rpmi 1640普通培养基（美国gibco公司）；新生牛血清（杭州四季青公司）；rt试剂盒（日本toyobo公司）；pcr试剂盒（广州东盛生物公司）；lxrα, angptl3和βactin引物（上海生物工程公司合成）；胆固醇酶联试剂（浙江伊利康公司）；pcr仪,geldoc 100凝胶成像仪（美国biorad公司）.
1.2 方法
1.2.1 细胞分组及培养 l02细胞以每孔3×105个细胞接种于培养板.在含100 ml/l新生牛血清的rpmi 1640培养液中培养36 h后，随机分为5组（g1～g5），分别在不同浓度葡萄糖的培养液中培养24 h. g1组为对照组.
1.2.2 胆固醇含量测定 5组l02细胞用rpmi 1640培养基培养24 h后，用pbs洗细胞2次，加细胞裂解液裂解细胞，30 min后再超声裂解4次，4℃ 12 000 g离心15 min. 用lowry法测定细胞裂解液的蛋白质含量. 胆固醇酶联法测定细胞裂解液的胆固醇含量. 胆固醇含量参数以细胞裂解液胆固醇含量除以细胞裂解液蛋白质含量表示(mg/g).
1.2.3 两种基因mrna表达的检测 按试剂说明，常规方法提取细胞总rna，检测总rna的纯度和完整性. 用rtpcr方法检测各基因的mrna表达量. lxrα上游引物：tcc cac gga tgc taa tg，下游引物：tcc cag gaa tgt ttg cc. angptl3上游引物：tcc aga aca ccc aga agt aac，下游引物：cca gcc tcc tga ata acc ct. βactin上游引物：tcc tcc ctg gag aag agc ta，下游引物：tca gga gga gca atg atc ttg. . pcr反应条件为：94℃预变性4 min后进行94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环，72℃延伸10 min. 取各基因扩增产物6 μl用于25 g/l琼脂糖电泳，溴化乙啶染色后采集图像,用angptll3，lxrα与βactin面积灰度值的比值表示各基因mrna的表达量.
统计学处理：用spss 13.0软件包进行统计 分析 . 数据以x±s表示，多组均数的比较采用单因素方差分析，两两之间比较用lsdt检验，p<0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 葡萄糖对细胞内胆固醇含量的 影响 随着环境葡萄糖浓度增加， 细胞内胆固醇含量也不断增加， g1～g5五组间总胆固醇含量相比较，差异具有统计学意义(p<0.05) . g2～g5组分别与g1组相比，g2组的总胆固醇升高，但差异无统计学意义(p>0.05)，而g3～g5组差异均有统计学意义(p<0.05). g3组，g4组和g5组三组间两两比较，差异均无统计学意义(p>0.05，表1).
表1 葡萄糖对l02细胞angptl3与lxrα表达和胆固醇含量的影响（略）
ap<0.05 vs g1.
2.2 葡萄糖对lxrα和angptl3 mrna表达的影响 随着葡萄糖浓度增加， lxrα和angptl3的mrna表达量均增加，g1～g5各组间相比较差异具有统计学意义(p<0.05). g2组与g1组比较，lxrα和angptl3 的mrna表达量升高，但差异无统计学意义(p>0.05)，g3～g5组分别与g1组比较，lxrα和angptl3 的mrna表达量差异均有统计学意义(p<0.05). g3组，g4组和g5组三组间两两比较，差异均有统计学意义(p<0.05，图1，2).
m：marker；1～5：依次为葡萄糖5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/l组.
图1 葡萄糖对l02细胞lxrα mrna表达的影响（略）
m：marker；1～5：依次为葡萄糖5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/l组.
图2 葡萄糖对l02细胞angptl3 mrna表达的影响（略）
2.3 葡萄糖对angptl3蛋白质表达的影响 在蛋白质表达水平，g2～g5组分别与g1组比较，差异均有统计学意义(p<0.05) .此外，g2～g5组间两两比较，除了g4组与g5组差异无统计学意义(p>0.05)，其它各组间差异均有统计学意义(p<0.05，图3).
1～5：依次为葡萄糖5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/l组.
图3 葡萄糖对l02细胞angptl3蛋白质表达的影响（略）
3 讨论
lxr是配体激活的转录因子［3］，其最有效的内源性激动剂是胆固醇的衍生物.大量 研究 表明lxrs可调节一系列与脂质代谢相关基因的表达，而维持脂质代谢的平衡［4］.angptl3是典型的lxr靶基因，在其启动子区域有lxr反应元件［5］，angptl3主要通过抑制脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, lpl)的活性导致以及低密度脂蛋白(very lowdensity lipoprotein, vldl)三酰甘油升高为主的高脂血症.已有研究表明，高浓度葡萄糖能上调细胞内angptl3的mrna和蛋白质表达，且在一定范围内呈正相关［6］. 本实验发现高浓度葡萄糖能增加l02细胞内胆固醇含量，但当葡萄糖浓度高于11.0 mmol/l后，葡萄糖对细胞内胆固醇的合成影响不明显，同时高浓度葡萄糖还上调了lxrα和angptl3的表达.kaplan等［7］研究发现高胆固醇饮食的小鼠肝脏angptl3表达明显增加，lxr激动剂t090137也会提高angptl3 mrna的水平.这与本实验结果是相符合的.结合本实验结果和 文献 报道，我们可以推测高糖可能通过增加细胞内胆固醇含量而激活lxrα，lxrα的激活能引起angptl3的mrna和蛋白质高表达，angptl3高表达可导致脂类代谢紊乱.因此，良好地控制血糖浓度，能够有效地维持糖和脂类的代谢平衡，lxrα和angptl3可能成为联系糖和脂类的代谢的重要分子.
【 参考 文献】
［1］ shimamura m, matsuda m, kobayashi s, et al. angiopoietinlike protein 3, a hepatic secretory factor, activates lipolysis in adipocytes［j］. biochem biophy res commum, 2003, 301(2): 604-609.
［2］ koishi r，ando y，ono m，et al. angptl3 regulates lipid metabolism in mice［j］.nat genet,2002,30(2):151-157.
［3］ lehmann jm，kliewer sa，moore lb，et al. activation of the nuclear receptor lxr by oxysterols defines a new hormone response pathway［j］. j bio chem, 1997,272(6 ):3137-3140.
［4］ 吴 静，张志文，管又飞.lxrs在脂质代谢中的作用［j］.生理 科学 进展,2004,35(1):69-72.
［5］ inaba t,matsuda m, shimamura m, et al. angiopoietinlike protein 3 mediates hypertriglyceridemia induced by liver x receptor［j］. j biol chem, 2003, 278(24): 21344-21351.
［6］ 李 倩，王继红，程 梅, 等. 葡萄糖对人肝细胞血管生成素样蛋白3表达的影响［j］.第四军医大学学报, 2008, 29(3): 277-280.
［7］ kaplan r,zhang t,hernandez m,et al.regulation of the angiopoitionlike protein 3 gene by lxr［j］. j lipid res, 2003, 44(1): 136-143.
