作者：李仲兴,王秀华,孟晓洁,杨敬芳,时东彦,王鑫
【摘要】 目的 观察五倍子乙醇提取物对表皮葡萄球菌的体外抗菌活性及其形态学变化。方法 采用新的中药抑菌实验方法对五倍子乙醇提取物进行124株表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度测定,同时用显微镜观察用药后菌细胞形态和结构改变。结果 五倍子乙醇提取物对43株耐甲氧西林的表皮葡萄球菌(mrse)和81株甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌(msse)的mic90分别为0.288、0.144 mg/ml；在显微镜下,经五倍子处理的表皮葡萄球菌菌细胞逐渐膨胀、增大,可能是五倍子进入菌细胞后,其抗菌物质与菌细胞发挥杀菌作用所致。膨胀到一定大小时细胞内含物逐渐消失。结论 五倍子乙醇提取物对表皮葡萄球菌具有较强的抗菌作用,可使菌细胞形态发生显著改变。
【关键词】 五倍子；乙醇提取物；耐甲氧西林表皮葡萄球菌；甲氧西林敏感表皮葡萄球菌；细菌形态
abstract：objective to evaluate the antibacterial activity in vitro of galla chinensis ethanol extractant (gcee) against s. epidermidis, and the change of cell morphology of s. epidermidis. methods deterimination of antibacterial activity of gcee against 124 strains s. epidermidis was performed by using agar dilution method, and the changes of cell merphalogy of s. epidermidis was examined by microscope. results the mic90 of gcee against 43 strains of mrse (methicillin-resistant staphylococcus epidermidis) and 81 strains of msse (methicillin-sensitive staphylococcus epidermidis) were 0.288 and 0.144 mg/ml respectively. under microscope, the cells of s. epidermidis were expansion by degrees, with the edge of cell of s. epidermidis irregular. the substances in cells of s. epidermidis were disappear final. conclusion galla chinensis ethanol extractant had strong antibacterial activity against 124 strains of s. epidermidis, and the cell morphology of s. epidermidis changed.
key words：galla chinensis；ethanol extractant；methicillin-resistant staphycoccus epidermidis；methicillin-sensitive staphycoccus epidermidis；bacterial morphology
在对抗感染中药的抑菌实验筛选中,发现五倍子对表皮葡萄球菌有极强的抑菌作用[1]。wWW.11665.com为了更好的发挥抗感染中药的抗菌作用,为临床应用打下基础,笔者将五倍子乙醇提取物进行了124株葡萄球菌的最低抑菌浓度测定,并用电镜观察五倍子对表皮葡萄球菌超微结构影响的同时,观察五倍子对表皮形态和结构的影响。现报道如下。
1 实验材料
1.1 菌种准备
从本院临床患者的血液、尿液、脓汁、痰等标本分离的表皮葡萄球菌共236株,均经api系统(法国生物梅里埃公司生产)及参照manual for clinical microbiology等进行鉴定[2]。鉴定后按nccls(2002年版)标准确定耐甲氧西林的表皮葡萄球菌(mrse)和甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌(msse)。质控菌株为金葡萄球菌atcc 25923,各菌株制成0.5麦氏单位的菌悬液。
1.2 仪器
微量多点接种仪,北京医科大学昆仑药物发展研究所生产。
1.3 培养基
mueller-hinton琼脂(美国bd公司生产),bbl,简称m-h琼脂,批号775661501。
1.4 药物
五倍子,购自河北省药材公司,先将五倍子按常法做成煎液,即50 g五倍子用文火煎后做成200 ml煎液(为25%五倍子水煎液),置4～8 ℃冰箱中过夜,过滤后按文献[3]制成五倍子乙醇提取物。
2 实验方法
2.1 五倍子对表皮葡萄球菌的抗菌实验
按文献[4]方法进行。
2.2 对五倍子处理后的表皮葡萄球菌进行形态学观察
将表皮葡萄球菌划线接种m-h琼脂平板,经35 ℃培养18～24 h,取单个菌落接种3 ml牛心汤培养基,经35 ℃培养6～8 h后,以无菌操作涂片,进行革兰染色,观察表皮葡萄球菌的形态,如正常则作为对照。将上述6～8 h培养的牛心汤培养物,立即加入五倍子水煎剂1 ml,混匀,于35 ℃培养。并分别于0.5、1、2、4、8、10、24 h以无菌操作涂片,行革兰染色,用光学显微镜观察表皮葡萄球菌的形态变化。
3 结果
3.1 五倍子对表皮葡萄球菌的抗菌效果
(见表1、表2)表1 五倍子乙醇提取物对124株表皮葡萄球菌(mrse和msse)的累计抑（略）表2 五倍子提取物对124株表皮葡萄球菌株的抑菌作用（略）
3.2 用光学显微镜观察五倍子对表皮葡萄球菌形态和结构的影响
用显微镜观察表皮葡萄球菌形态。先用低倍镜和高倍镜观察,找到适当视野时,再用油镜仔细观察细菌形态变化。正常表皮葡萄球菌在油镜下,其形态为大小相等、染色一致的革兰阳性球菌(见图1)。表皮葡萄球菌的牛心汤培养液加入五倍子提取物后,菌细胞由小变大,即逐渐膨胀、增大(见图2、图3),可能是五倍子进入菌细胞后,其抗菌物质与菌细胞发挥抑菌作用所致,实际上菌细胞已经死亡。菌细胞膨胀到一定大小时,细胞内含物包括细胞壁和细胞质逐渐消失(见图4、图5),最后菌细胞的内含物全部消失,只剩下菌细胞的影子(见图6)。
4 讨论
本实验观察五倍子对表皮葡萄球菌菌细胞形态的影响,结果表明,正常表皮葡萄球菌在油镜下是大小一致、排列整齐、表面光滑、染色一致的革兰阳性球菌。表皮葡萄球菌的牛心汤培养物,加入五倍子提取物后,菌细胞由小变大,逐渐膨胀,且大小不一。可能是五倍子进入菌细胞后,其抗菌物质与菌细胞作用所致,实际上菌细胞已经死亡。膨胀到一定大小时,其细胞壁结构、层次不清,胞浆膜和细胞质结构模糊,这与电镜下所观察的表皮葡萄球菌菌细胞的变化相似,但在显微镜下可看到菌细胞的内含物逐渐消失,最后菌细胞的内含物全部消失,只剩下菌细胞的影子。表明五倍子对表皮葡萄球菌的细胞壁和细胞质均有影响。通过对五倍子乙醇提取物进行抑菌效果检测,其结果表明,五倍子乙醇提取物对表皮葡萄球菌,无论是mrse还是msse,均有很强的抑菌力,对mrse抑菌作用更强。其对mrse的mic90为0.288 mg/ml,对msse的mic90为0.144 mg/ml。说明五倍子抗菌作用很强。
据报道,抗菌药物的作用机制之一就是干扰细菌细胞壁的合成,多数青霉素类和头孢菌素类等β-内酰胺类抗生素,主要与青霉素结合蛋白[pbp1和(或)pbp3]结合,形成丝状体和球形体,然后细菌变形萎缩,逐步溶解死亡[5]。而万古霉素的作用位点处于β-内酰胺类抗生素作用位点的上游,它抑制细胞壁合成的第二阶段(类脂结合)中的一个关键的转化反应,即当万古霉素与在udp-五肽末端的d-丙氨酰-d-丙氨酸末端游离羧基紧密结合,就抑制了有功能的肽聚糖形成过程中所需的转糖苷作用和转肽作用的最后步骤,导致细菌细胞的溶解[6]。从而可以初步认为,五倍子对表皮葡萄球菌的抗菌作用是干扰细胞壁合成,同时又损伤胞浆膜,使细菌溶解、破裂而死亡。
【参考文献】
[1] 李仲兴,张立志,王秀华,等.五倍子对224株耐甲氧西林葡萄球菌(mrsa和mrse)的抑菌效果观察[j].中国中医药信息杂志,2001,8(12)：32－34.
[2] murray pr. manual of clinical microbiology[m].8th ed.washington dc：american society for microbiology,2003.384－404.
[3] 董方言.现代中药新剂型新技术[m].北京：人民卫生出版社,2001.8－13.
[4] 李仲兴,王秀华,赵建宏,等.应用m-h琼脂进行连翘体外抗菌实验的效果观察[j].中国中药杂志,2000,25(12)：742－745.
[5] 戴自英,刘裕昆,汪 复.实用抗菌药物学[m].第2版.上海：上海科学技术出版社,1998.12－18.
[6] 陈代杰.抗菌药物与细菌耐药性[m].上海：华东理工大学出版社, 2001. 139－141.
