作者：王敏，刘伟，杨爱军，王晨昱，李敏
【摘要】 目的： 研究 血管性血友病因子（vwf）及组蛋白去乙酰化酶1（hdac1）在人胃癌细胞株bgc823中的表达及对细胞粘附、侵袭、迁移能力的 影响 ，并探讨其机制. 方法 ：体外培养人胃癌细胞株bgc823，分别以vwf抗体（vwf ab）及hdac1抗体(hdac1 ab)作用处理；用rtpcr和免疫细胞化学方法检测细胞中vwf和hdac1的表达及相互作用. 噻唑兰比色（mtt）法检测对细胞外基质成分ⅳ型胶原粘附能力的变化；boyden小室法检测细胞侵袭、迁移能力的改变. 结果：bgc823细胞能够表达vwf和hdac1；经hdac1 ab处理后，细胞中vwf mrna相对含量由处理前的0.2134增加到0.3214，vwf蛋白表达增强；vwf ab处理组细胞的粘附率较未处理组明显下降（p<0.01）；vwf ab处理组细胞侵袭、迁移穿膜细胞数分别为54.86±9.94和60.47±16.20，与空白对照组相比较差异具有统计学意义（p<0.01）. 结论：人胃癌细胞株bgc823能够表达vwf 及hadc1；hdac1可调节vwf的表达；vwf在 bgc823细胞的粘附、侵袭及迁移过程中起重要促进作用.
【关键词】 胃肿瘤；细胞系，肿瘤；von willebrand因子；组蛋白去乙酰化酶1；肿瘤转移
【abstract】 aim: to investigate the expressions and effects on adhesion, invasion and motility of von willebrand factor (vwf) and histone deacetylase 1 (hdac1) in human gastric cancer cell line bgc823 in vitro and the related mechanism of antimetastasis. methods: human gastric cancer cell line bgc823 cultured in vitro were treated respectively with vwf antibody (vwf ab) and hdac1 antibody (hdac1 ab). the expressions of vwf and hdac1 in bgc823 were detected by rtpcr and immunocytochemistry. the effects of vwf and hdac1 on the adhesion, invasion and motility of human gastric cancer cell line bgc823 in vitro were explored respectively by mtt colorimetric assay and boyden chamber. results: the human gastric cancer cell line bgc823 expressed vwf and hdac1. after treatment with hdac1 antibody, the expression level of vwf mrna in bgc823 was increased from about 0.2134 to 0.3214, and the expression of vwf protein was increased. compared with the control group, the adhesion, invasion (54.86±9.94) and motility (60.47±16.20) abilities of the bgc823 cells were decreased significantly (p<0.01) after treatment with vwf antibody. conclusion: human gastric cancer cell line bgc823 can express vwf and hdac1, and the expression of vwf can be regulated by hdac1. vwf takes an important part in the adhesion, invasion and motility of the bgc823 cells.
【keywords】 stomach neoplasms; cell line, tumor; vwf; hdac1; neoplasm metastasis
0 引言
血管性血友病因子（von willebrand factor，vwf）生理状态下参与凝血的发生，但 目前 临床研究报道其与结肠癌［1］、骨肉瘤［2］和恶性黑色素瘤［3］等肿瘤的转移也有密切关系. 组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase，hdac1）作为调控基因的关键酶，参与了vwf的转录调节［4］，其功能异常也被证实与恶性肿瘤的发生和 发展 有关［5］. 截至目前，关于vwf和hdac1对胃癌细胞转移能力影响的体外研究尚少见报道. 我们以胃癌细胞bgc823为研究对象，采用vwf抗体及hdac1抗体进行体外干预，观察vwf和hdac1的表达、相互作用和对细胞粘附、侵袭、迁移能力的影响，并初步探讨其作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 rpmi1640（美国gibco公司）；胰酶(美国amresco公司)；超级新生牛血清（fbs）（杭州四季青生物工程有限公司）；ⅳ型胶原（兰州大学病理研究所自制）；四甲基偶氮唑蓝（mtt）及牛血清白蛋白（bsa）（美国sigma公司）；兔抗人vwf多克隆抗体（ab6994，英国abcam公司）；兔抗人hdac1多克隆抗体（ba0914）及sp免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；trizol试剂、rtpcr两步法试剂盒及焦碳酸二乙酯(depc)（上海生物工程有限公司）；目的基因、内参引物及marker（d512a）（takara）；博伊登(boyden)小室与多聚碳酸酯膜(8.0 μm孔径)（美国millipore公司）；人胃癌细胞株bgc823（ 中国 科学 院上海细胞生物研究所）.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 用含100 ml/l灭活新生牛血清的rpmi1640培养液（含105 u/l青霉素、100 mg/l链霉素）在37℃ 50 ml/l co2及饱和湿度的培养箱中维持培养.
1.2.2 sp法免疫细胞化学染色 取对数生长期bgc823细胞，消化离心后，将细胞悬液加入已预置无菌小玻片的12 孔板中，每孔含细胞2×104个，培养36 h后，取出盖玻片，pbs 洗3次，4℃无水乙醇固定. 免疫组化参照试剂说明书进行，苏木精轻度复染，脱水透明，显微镜下观察结果. pbs代替一抗做阴性对照. 判断标准：hdac1以细胞核呈清晰棕黄色颗粒为阳性细胞，vwf以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞.
1.2.3 rtpcr
1.2.3.1 细胞处理 实验分为对照组：无任何干预，细胞在37℃ 50 ml/l co2条件下培养 48 h后检测vwf mrna及hdac1 mrna表达；vwf ab处理组：用20 μg/ml vwf ab作用细胞 48 h后，检测hdac1 mrna表达；hdac1 ab处理组：用10 μg/ml hdac1 ab作用细胞 48 h后，检测vwf mrna表达.
1.2.3.2 两步法rtpcr 用 trizol试剂提取细胞总rna，参照amv第一链cdna合成试剂盒说明书操作合成cdna，以oligodt为引物反转录，vwf及hdac1特异引物进行pcr扩增，vwf的引物序列为，上游5′ ataggagcacaccccttgc 3′，下游5′ cactttgtcgcccattatcc 3′，大小为141 bp；hdac1的引物序列为，上游5′ ctctccagctctggcttcc 3′，下游5′ agacctggcaccctttatgg 3′, 大小为234 bp；以gapdh为内参照，引物序列为，上游5′ ttctccccattccgtcttcc3′，下游5′ gtacatggtattcaccaccc 3′，大小为456 bp. 反应条件：vwf及gapdh条件一致：94℃变性 4 min, 94℃ 30 s, 52℃ 40 s, 72℃ 50 s,共循环36次后72℃延伸5 min；hdac1为94℃变性4 min, 94℃ 30 s, 54℃ 40 s, 72℃ 50 s，共循环45次后72℃延伸5 min. 扩增产物进行1.5 g/l琼脂糖凝胶电泳，电泳图像经凝胶成像扫描仪 分析 ，比较vwf和hdac1相对表达量.
1.2.4 粘附抗体抑制实验 分别将20 μg/ml vwf ab和10 μg/ml hdac1 ab加入rpmi1640培养基中，与bgc823细胞共培养48 h；将96孔板预先用3 g／ml ⅳ型胶原20 μl／孔包被，20 ml/l bsa封板处理，加入调好的细胞悬液200 μl／孔（5×105个／ml）；co2培养箱分别孵育30，60，90和120 min后，弃去培养液，pbs冲洗除去未粘附细胞；弃pbs后加入mtt 20 μl，及无血清rpmi1640 200 μl，co2孵育3 h；吸弃培养孔内上清液，加入二甲基亚砜（dmso） 200 μl溶解，噻唑兰显色，酶联免疫检测仪570 nm处测各孔吸光度（a570 nm）值，同时设立相应的rpmi1640培养对照组. 各组重复3次.
1.2.5 体外侵袭抑制实验 分别将 20 μg/ml vwf ab, 10 μg/ml hdac1 ab和vwf ab及hdac1 ab混合液加于无血清rpmi1640培养基中，与bgc823细胞共培养 48 h，对照组不做抗体处理；在boyden小室的下室加入含有 500 ml/l fbs的培养液200 μl，上下室之间用孔径8 μm的聚碳酸酯膜分开，膜上均匀铺浓度为3 g／ml 的ⅳ型胶原50 μl／室，将小室置于37℃温箱中聚合30 min. 上室内加入预处理的细胞悬液200 μl／室（含2×105个细胞），37℃ 50 ml/l co2条件下放置48 h. 弃上室液体，用棉签擦掉膜上未侵袭细胞及胶，pbs洗3次，950 ml/l乙醇固定15 min，常规he染色. 结果判定：在400倍光镜下每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数， 计算 平均每个视野的细胞数. 实验组和对照组重复3次. 按下式计算抗体作用对细胞侵袭的抑制率(ir): ir(%)=(1-实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)×100%.
1.2.6 体外迁移抑制实验 细胞处理同侵袭实验，聚碳酸酯膜表面不铺胶，其余步骤同侵袭实验. 通过计数穿膜细胞数反映vwf及hdac1对bgc823细胞体外迁移能力的影响. 按下式计算抗体作用对细胞迁移的抑制率(ir): ir (%)=(1-实验组平均迁移细胞数/对照组平均迁移细胞数)×100%.
统计学处理：采用spss 11.5统计软件进行 分析 . 计量资料以x±s表示，组间差异比较采用方差分析，两两组间多重比较采用lsdt检验，p<0.05为差异具有统计学意义.
2 结果
2.1 vwf和hdac1蛋白的表达及相互 影响 免疫组化染色结果显示：hdac1蛋白阳性表达呈深棕色颗粒，主要位于细胞核，呈强表达，胞浆也有少量表达（图1a）；经20 μg/ml vwf ab处理48 h后，表达无明显变化. vwf蛋白阳性表达呈浅棕色颗粒，位于细胞浆，表达较弱（图1b）；经10 μg/ml hdac1 ab处理48 h后，vwf蛋白表达增强，阳性细胞数增多（图1c）.
a: hdac1; b: vwf; c: 处理后vwf.
图1 vwf和hdac1在胃癌细胞bgc823中的表达 sp ×400（略）
2.2 vwf和hdac1 mrna的表达及相互影响 rtpcr结果显示: vwf mrna在bgc823细胞中相对表达值为0.2134；hdac1 ab处理细胞后vwf mrna水平增高，相对值为0.3214；hdac1 mrna在bgc823细胞中相对表达值为0.8992， vwf ab处理细胞后其表达水平与处理前相比较无明显改变， 相对值为0.8790（图2）.
1～4：gadph分别对应为6～9的内参；5：d512a marker；6：空白组hdac1；7：hdac1 ab处理组；8：vwf ab处理组；9：空白组vwf.
图2 胃癌细胞bgc823中vwf mrna及hdac1 mrna的表达（略）
2.3 vwf ab和hdac1 ab对bgc823细胞与细胞外基质成分粘附能力的影响 经vwf ab和hdac1 ab分别作用细胞48 h后，随着时间延长，bgc823细胞在ⅳ型胶原上的粘附增加；vwf ab处理组细胞与对照组比较，在各时间点上粘附明显下降，差异有统计学意义（p<0.01）；hdac1 ab处理组细胞与对照组比较无明显变化（表1）.
2.4 vwf ab和hdac1 ab单独及联合作用对bgc823细胞体外侵袭、迁移能力的影响 boyden小室实验结果显示：vwf ab处理组侵袭穿膜细胞数为54.86±9.94，迁移穿膜细胞数为60.47±16.20，与对照组比较差异有统计学意义(p<0.01）；hdac1 ab处理组和协同处理组分别与对照组比较，侵袭、迁移穿膜细胞数差异无统计学意义(p>0.05, 表2，图3）.
表1 vwf ab和hdac1 ab对bgc823细胞与ⅳ型胶原粘附能力的影响(a570 nm值)（略）
ap<0.05, bp<0.01 vs对照.
表2 vwf ab和hdac1 ab单独及联合作用对bgc823细胞侵袭、迁移能力的影响（略）
bp<0.01 vs对照; dp<0.01 vs其他处理.
a: 对照组; b: vwf ab处理组.
图3 侵袭实验穿膜细胞 he ×100（略）
3 讨论
目前 vwf在恶性肿瘤转移中的作用仍存在争议. 有 研究 表明发生转移的结肠癌患者血浆vwf水平增高［1］，提示vwf能够促进转移的发生. terraube等［3］研究发现对于vwf基因缺陷荷瘤小鼠，恶性黑色素瘤的转移潜能增加，揭示vwf有抑制肿瘤转移的作用, 表明vwf在不同的肿瘤中可能分别发挥促进或抑制转移的作用. 本实验探讨了vwf在胃癌细胞体外转移中的作用, 结果表明, 人胃癌细胞bgc823可以产生少量vwf，说明vwf除了由血管内皮细胞和巨核细胞合成外，亦可由肿瘤细胞自身分泌产生；用抗vwf抗体阻抗vwf作用后，bgc823细胞与细胞外基质的主要组成成分－ⅳ型胶原的粘附能力以及体外的侵袭、迁移能力相应降低. 可能的机制是：肿瘤细胞自身产生的部分vwf，与肿瘤细胞直接粘附，或与肿瘤细胞表面相关粘附分子粘附，通过其“桥梁”作用，促进肿瘤细胞与细胞外基质相粘附，进而改变侵袭、迁移相关性质，提高了肿瘤细胞侵袭、迁移能力. 此外，实验结果还表明，随着时间的延长，细胞的粘附增加，表明肿瘤细胞与细胞外基质的粘附呈时间依赖性.
大量研究［6］证实，组蛋白异常去乙酰化与恶性肿瘤的发生有关. hdac1作为调控基因的蛋白酶，具有抑制基因转录的作用，在细胞周期进展和分化中发挥重要的作用，参与vwf的转录调节过程［4］，并在多种肺癌细胞系中高表达［7］. 我们研究结果表明bgc823细胞能表达hdac1，但其对于肿瘤细胞粘附、侵袭迁移能力无明显直接影响. 我们用抗hdac1抗体阻抗hdac1作用，诱导组蛋白高乙酰化后，结果显示vwf mrna及蛋白质水平相对增高，提示 hdac1作为vwf的作用因子之一，能部分调节vwf的表达. 同时，观察到两者的联合作用对细胞侵袭、迁移能力的影响与未处理组比较无明显差异，可能由于封闭hdac1作用后增加了vwf的表达，同时加入的vwf抗体抵消了相应的效应，具体的作用机制，还需要进一步研究.
综上所述，本实验证实了人胃癌细胞株bgc823能够产生少量vwf；hdac1可对 vwf的表达进行调节；vwf能够增加肿瘤细胞的粘附、侵袭迁移能力，在肿瘤转移中发挥重要作用.
【 参考 文献 】
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