摘要】 目的 了解急性早幼粒细胞白血病(apl)患者血浆中血小板颗粒膜蛋白140 (gmp140)及血管性血友病因子(vwf)水平的变化规律，以期为临床诊治apl合并的凝血病提供理论依据。方法 (1)应用双抗体夹心elisa法检测apl患者初诊、治疗中(第14 天左右)、缓解时及正常人的血浆gmp140水平，并计算gmp140(ng)/107血小板数;(2)应用增强免疫胶乳法测定上述各期患者的血浆vwf：ag水平。结果 (1)apl患者在初诊与治疗中gmp140(ng)/107血小板数(4.55±3.10，4.73±2.78)显著高于正常对照(0.94±0.67)(p<0.01)，缓解期(1.08±0.65)则与正常对照无显著差异(p>0.05)。(2)apl患者各病期vwf水平(%)(初诊时245.00± 82.83，治疗中257.22±104.18，缓解期193.62± 61.15)均较正常对照组(129.34± 34.57)升高(初诊和治疗中p<0.01，缓解期p<0.05);缓解时的vwf水平较初诊时、治疗中明显下降(p<0.05)。结论 apl患者发病过程中可能存在着血小板活化及内皮损伤，随着化疗的进行，骨髓造血逐渐改善，血小板的功能趋于正常;而内皮损伤恢复更慢，因而化疗中及化疗后期也应注意血栓的形成。
【关键词】 急性早幼粒细胞白血病; gmp140; vwf
a study on gmp140 and vwf levels in patients with acute promyelocytic leukemia
sun mingyan ， xie jing， chen lijun， li jiazeng，ma jun
(harbin instatute of hematology & oncology，harbin first hospital，harbin，150010，china)
abstract： objective to investigate the changes of granular membrane protein 140kd ( gmp140) and von willenbrand factor( vwf) levels in patients with acute promyelocytic leukemia( apl). we hope to provide some useful information for the early diagnosis of aplcomplicated hemorrhage for patients with apl during clinical treatment.methods (1) the concentration of gmp140 in plasma of apl patients were determined using commercially available enzymelinked immunosorbent assay (elisa)，and gmp140(ng)/107 platelets was calculated. (2) the level of vwf:ag in plasma of all the cases were determined using the enhanced immunolatex assay. results (1)the gmp140(ng)/107 platelets in the cases of incipient and treatment stage increased overtly than that of control group (p<0.01),while patients got relieved there was no statistical difference (p>0.05) between patients and control group. (2)the vwf levels of all stages increased overtly than that of control group (incipient and treatment stage ，p<0.01;relieved stage，p<0.05).compared with incipient and treatment stage, the vwf levels of relieved stage was decreased significantly(p<0.05). conclusions the activating of platelets and the damaging of endothelium exist during the apl process. along with the chemotherapy,bone marrow hematopoiesis become recovery, the platelets change to be normal ,but the recovery of endothelium were more slowly.
key words： acute promyelocytic leukemia; gmp140 ; vwf ;
急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,apl)是一组特异性基因活化性恶性造血系统肿瘤，属特殊类型的白血病。wwW.11665.com其最大的临床特点是容易发生apl相关凝血病，大约80%的m3患者在诊断确立时即有凝血异常，这些患者在化疗过程中往往因早幼粒细胞的破坏裂解而进一步加重出血，患者极易合并dic导致出血死亡。为了深入了解这种凝血障碍的发病机制，减少apl患者在诊治过程中的早期死亡率，国内外学者们从白血病细胞出发，在其促凝血及引发的纤溶亢进方面做了大量的工作。血小板活化和内皮损伤在止血与血栓过程中发挥着重要的作用，肿瘤细胞可以激活血小板，使血小板聚集和释放活性物质[1]，而颗粒膜蛋白140 ku (granular membrane protein 140 ku , gmp140) 亦称p选择素是血小板激活的特异性分子标志物;血管性血友病因子(vwf)升高可反映内皮细胞受损, 介导血小板的黏附、聚集，对判断血栓性危险及病情轻重有重要意义。这些方面的研究在心血管疾病中较多见，近些年在白血病中也有报道，但在apl这一特殊白血病中的联合检测未见报道。
本研究选择了初诊的apl患者，并跟踪观察其在发病时、治疗中和缓解时gmp140及vwf的的变化，我们期望从血小板激活和内皮损伤的角度来探讨apl伴发的凝血障碍的发病机制。
1 资料与方法
1.1 临床资料
1.1.1 27例初诊apl患者，男17例，女10例，年龄12～59岁，均为我所2006年3月～2007年2月的住院患者。初诊及完全缓解的诊断均符合2007年张之南和沈悌主编的《血液病诊断及疗效标准》[ 2]。另有2例患者治疗过程中突发脑出血死亡，被排除。
1.1.2 正常对照组为20例健康的工作人员，男8人，女12人，年龄19～54岁。
1.1.3 患者的分期
1.1.3.1 初诊时：未经治疗的apl患者。
1.1.3.2 治疗中：初诊患者，经全反式维甲酸(atra)和三氧化二砷(as2o3)二者联用,治疗第14±3 d，避开血小板输注当天，采取患者标本。
1.1.3.3 缓解期：患者的骨髓像及外周血像均符合完全缓解标准[1]。
1.2 实验样本的留取 于清晨空腹、静息时采集正常对照组和初诊、治疗中、完全缓解的apl患者的edta抗凝血 2 ml× 2管 、橘橼酸钠抗凝血 3 ml × 1管。其中，一管edta抗凝血和橘橼酸钠抗凝血立即3 000 /min离心10 min，分别分离血浆，做好标识，并以封口膜封口，存放于-80℃超低温冰箱，留作gmp140和vwf检测。另一管edta抗凝血，作全血常规检测。
1.3 统计学处理 应用t检验。
2 结 果
2.1 apl患者gmp140水平的变化
2.1.1 与正常对照组的比较 血浆检测结果显示 apl患者初诊和缓解时的gmp140水平(ng/ml)与正常对照组相比，无显著差异(p>0.05);治疗中略低于对照组，但无显著差异(p>0.05)。见表1。检验结果与血小板数(104/μl)的比值 gmp140(ng)/107血小板数显示 apl患者初诊与治疗中比值显著高于正常对照(p<0.01);缓解期则与正常对照无显著差异(p>0.05)。见表1。
2.1.2 不同病期间的比较 apl患者初诊、治疗中及缓解期gmp140血浆浓度(ng/ml)的变化不显著，两两之间无显著差异(p>0.05)。见表1。gmp140血浆浓度与血小板数(104/μl)的比值 gmp140(ng)/107血小板数显示，apl患者初诊与治疗中的比值均显著高于缓解期(p<0.01)。见表1。
2.2 apl患者的vwf：ag水平的变化
2.2.1 与正常对照组的比较 apl患者的vwf：ag水平(%)初诊时及治疗中、显著高于正常对照组(p<0.01);而缓解时的vwf：ag水平也高于正常对照组，且有统计学意义(p<0.05)。见表1。
2.2.2 不同病期间的比较 apl患者治疗中的vwf：ag水平(%)比初诊时略高，但无显著性差异(p>0.05);缓解时的vwf：ag水平比初诊和治疗中均显著降低(p<0.05)。见表1。表1 apl不同病期gmp140与vwf：ag水平的改变
▲与正常对照组相比，p<0.05.# 与初诊和治疗中相比，均有p<0.05.* 与正常对照组相比，p<0.01 .△ 与初诊和治疗中相比，均有p<0.01
3 讨 论
在急性早幼粒细胞白血病(apl)的发生发展过程中，其所伴发的凝血障碍往往十分严重，这也是apl患者早期死亡的重要原因。人们对于apl相关凝血病的机制在过去20年里已有了较为深入的了解，并从白血病细胞本身出发，在其促凝、促纤溶方面做了大量的工作。近些年，研究人员对血小板的激活状态及内皮细胞受损情况越来越重视，这无疑给apl相关凝血病的机制研究开辟了一个新的领域。同时，对急性白血病(acute leukemia，al)化疗过程中骨髓恢复状况的检测也日益受到重视。我们的研究正是从这几个方面入手，以期从血小板活化和内皮损伤的角度来解释apl的凝血障碍和炎性反应，帮助临床及时地纠正出血和抗炎治疗。
3.1 apl患者血浆 gmp140的变化 gmp140是存在于血小板α颗粒膜和血管内皮细胞内weibel palade小体中的一种膜糖蛋白。当血小板被激活或内皮细胞损伤时， gmp140从α颗粒膜转至浆膜，在血小板表面有大量表达，但gmp140在血小板表面的表达是暂时性的，很快脱落至循环中。还有一些gmp140缺乏穿膜区，可直接从话化的血小板释放至循环中，从而可以解释释浆中gmp140含量的增加，它更能直接反映血小板活化程度，是一种血小板激活时特异的分子标志物[ 3，4]。此外， gmp140具有黏附分子的作用，可介导血小板与中性粒细胞和单核细胞黏附，加重炎症反应[5]。
我们检测apl各病期的血浆gmp140水平，发现它们与正常对照并无显著差异。余自强等[6]检测了多种急性白血病(al)初诊及缓解时的血浆gmp140水平，发现初诊时明显升高，而缓解时降至正常，这与我们的结果不同。我们推测可能是各种al发病时血小板数参差不齐之故。他们做的是多种al的共同分析，而我们针对的是apl患者，后者在初诊和治疗时出血更为严重，且外周血小板数普遍较低，即使每个血小板分泌到血浆的gmp140增加，但表现在血浆浓度上并未见增高。因而我们采用血浆gmp140水平与外周血小板(104/μl)的比值，用其来代表单位数量的血小板分泌到血浆的gmp140水平。结果初诊和治疗中患者的该比值均显著高于正常对照和缓解期，说明apl患者发病初期和治疗过程中血小板均处于激活状态，这促进了apl发展过程中血栓的形成，从而使其伴随的凝血病的进一步加重。我们也将进一步分析外周血小板计数与血浆gmp140水平的相关程度。
3.2 apl患者血浆vwf的变化 血管内皮细胞覆盖在血管内腔表面，其基本功能具有抗血栓形成，调节血管张力，促血栓形成，介导炎症和免疫反应以及促血管修复作用。vwf 是主要由内皮细胞合成和分泌的一种多聚体糖蛋白，储存于weibelpalade小体中，在内皮细胞损伤时释放入血。因此，vwf可作为反映内皮细胞的功能状态和损伤程度的指标[7，8]。同时、vwf也可作为反映血液高凝状态、评估疾病严重程度的指标[9]。
我们的研究显示，apl患者不同病期的vwf水平均较正常对照升高，虽然缓解时比初诊和治疗中有所降低，但仍高于正常对照。这提示我们，apl患者血浆vwf升高原因可能是由于白血病细胞广泛浸润使血管内皮细胞(vessel endothelia cell，vec)受损, 合成和释放vwf增加所致, 同时可能使肝脏网状内皮系统清除vwf能力下降。
沈建箴等[10]报道al 患者血浆vwf 大分子多聚体比例下降，同时发现al 患者初治时vwf升高越明显则反映白血病细胞浸润越广泛, vec 受损程度越重, 从而使vec 调节止血平衡的功能失调, 加重出血。余自强等[6]也检测了急性白血病(al)初诊及缓解时的血浆vwf水平，发现初诊时明显升高，而缓解时降至正常，这与我们检测到的缓解期vwf水平略高有所不同。我们分析，可能是由于我们检测的是初诊入院，经治疗达到缓解的患者，在骨髓象和血象达到缓解时，采取其血液样本进行检测，而非长期缓解后复查的患者。因而我们认为，血浆vwf水平的降低可能是循序渐进的，即血管内皮的损伤恢复需要一个更长的过程。我们也将对长期缓解的apl患者进行vwf的跟踪检测，以进一步了解患者血管内皮损伤与修复过程以及其对患者预后的影响。同时，我们也建议，在apl白血病的治疗过程中除了及时纠正凝血障碍，保护血管内皮、降低炎症反应的抗炎治疗亦不可或缺。
【参考文献】
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[6] 余自强，蔡晓燕，吴树农.急性白血病血浆gmp140和vwf检测及其临床意义[j].白血病，1997，6(2)7477.
[7] boneu b. factor ⅷ complex and endothelial damage[j].lancet, 1975,1: 14301435
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[9] hoyer l w. the factor ⅷ complex: structure and function[j].blood,1981, 58: 113.
[10] 沈建箴, 吕联煌, 张学敏. 急性白血病von willenbrand 因子的研究[j]. 中华医学杂志, 1990; 70: 2628.
