【摘要】 目的： 探讨人重组促红细胞生成素(rhuepo)对大鼠缺血/再灌注(i/r)心肌细胞的保护作用. 方法 ： 常规酶解法获得成年大鼠心室肌细胞,用氰化钠/乳酸钠灌注造成细胞化学缺氧以模拟缺血. 缺血15 min后以台氏液或台氏液加rhuepo复氧模拟再灌注，用可视化动缘探测系统同步检测rhuepo对单个i/r心室肌细胞收缩力和钙瞬变的 影响 . 结果： 发现rhuepo使再灌注后心室肌细胞肌小节最大收缩幅度、最大缩短速率、最大复长速率以及ca2+荧光比率增大，使ca2+达峰值时程、舒张期ca2+减少50％时程减少(p<0.05, n=10，来自8个心脏). 结论：rhuepo可促进i/r心室肌细胞收缩及钙瞬变的恢复而发挥其保护作用.
【关键词】 重组促红细胞生成素；缺血;再灌注损伤；心肌细胞；收缩功能；钙瞬变
【abstract】 aim: to determine the protective effect of recombinant human erythropoietin (rhuepo) on ischemia/reperfused cardiomyocytes. methods: ventricular myocytes were enzymatically isolated from adult sd rats. chemical anoxic solution including sodium cyamide/sodium lactate was used to simulate myocardial ischemia. after 15 min of ischemia, myocytes were reperfused with tyrodes solution with or without rhuepo for 30 min. contribution of rhuepo to systolic/diastolic function and intracellular calcium transient in isolated i/r ventricular myocytes was assessed by videobased motion edgedetection system. results: reperfusion with rhuepo increased peak twitch amplitude, maximal velocity of shortening, maximal velocity of relengthening of myocytes shorterning and fluorescence ratio ca2+, and decreased time to peak ca2+, time to 50% diastolic ca2+ compared with those in cells reperfused with vehicle (n=10 myocytes from 8 hearts, p<0.05). conclusion: treatment with rhuepo during reperfusion facilitates the recovery of systolic/diastolic function and calcium transient in simulated i/r cardiomyocytes.
【keywords】 recombinant erythropoietin； ischemia; reperfusion injury；cardiomyocyte；contraction；calcium transient
0 引言
近年 研究 发现，人重组促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhuepo)预处理能显著改善离体心肌缺血再灌注后血流动力学和心肌酶谱［1］. 由于可视化动缘探测系统因其操作简便、直观，可实时同步记录心肌细胞机械功能变化和细胞内钙瞬变等，已成为心肌细胞生 理学 研究领域 应用 较广泛的技术之一［2］. 本研究利用心肌细胞模拟i/r模型，采用可视化动缘探测系统，同步检测rhuepo对离体缺血/再灌注(i/r)大鼠心肌细胞收缩、舒张功能和钙瞬变的影响，以探讨rhuepo对大鼠i/r心肌细胞的保护作用.
1 材料和方法
1.1 材料 成年sd大鼠12只,体质量220～260 g，雌雄不拘, 正常饮食（第四军医大学实验动物心）；rhuepo（沈阳三生制药有限公司）；胶原酶ⅱ(collagenaseⅱ，美国worthington biochemical公司）；牛血清白蛋白(美国sigma chemical公司)； fura2/am（美国alexis公司）； 双激发荧光光电倍增系统可视化动缘探测系统（美国ionoptix公司）.
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞分离 采用戊巴比妥钠(30 mg／kg，ip)麻醉并肝素化(1000 u／kg，iv)大鼠后，开胸并立即取出心脏，保留足够长的主动脉，以便于插入和固定于灌流系统心脏套管. 速置于预冷的无钙台氏液(mmol／l) (nacl 143，kcl 5.4，mgcl2 0.5，nah2po4 0.3，hepes 5.0，葡萄糖5.0, ph 7.2, 4℃)中. 将langendorff灌流套管套入主动脉(不能套入过长，以免套管逾主动脉瓣插入左心室)并固定，尽快开始灌流. 先以预充混合气体的无钙台氏液(ph 7.2，以950 ml/l o2+50 ml/l co2混合气体饱和)灌流心脏2～3 min，使其停跳；再换含0.4 g／l胶原酶ⅱ(270 u／mg)和0.7 g／l牛血清白蛋白的无钙酶液灌流20～25 min. 待心脏变松软、灌流液流出速度明显加快后再用无钙台氏液灌流冲洗残留酶液约5 min. 上述灌流过程中，若心脏一直呈粉红色，表明心肌细胞存活. 将心室组织剪下，置于含20 g/l bsa的kb液(mmol／l) (左旋谷酰胺70，kcl 25，牛磺酸20，kh2po4 10，mgcl2 3.0，egta 0.5，hepes 10，葡萄糖10，ph 7.2)中. 将心室组织撕碎，以粗头吸管轻轻反复吹打后，经200目细胞滤网过滤细胞悬液. 室温静置10 min使存活(viable)心肌细胞沉降，换含20 g/l bsa的新鲜kb液. 静置40 min后,以0.1 mol／l cacl2逐步复钙，使细胞悬液ca2+终浓度为1.8 mmol／l，得到钙耐受心室肌细胞，室温下将其保存在含l.8 mmol／l cacl2的台氏液中. 分离所得杆状心肌细胞>80％，钙耐受存活心肌细胞>60％［3］.
1.2.2 建立i/r模型 根据seki等［4］的方法, 采用氰化钠乳酸钠化学缺氧法模拟缺血. 台氏液灌流心肌细胞约5 min, 并给予电场刺激(0.5 hz,5 ms), 待细胞收缩稳定后,以化学缺氧液(nacl 121, kcl 5.4, mgcl2 0.5, nah2po4 0.3, cacl2 1.8, nacn 2.0 和乳酸钠20 mmol/l, ph 7.2～7.4)进行灌流. 模拟缺血灌流15 min 后, 对照组以含氧台氏液再灌注, rhuepo组在台氏液再灌注的同时给予rhuepo.
1.2.3 心肌细胞收缩检测 心室肌细胞收缩采用ionoptix 单细胞动缘探测系统同步检测心肌细胞收缩及钙瞬变. 将心肌细胞置于倒置显微镜(olympus)载物台上的细胞灌流小室内, 以含氧台氏液灌流(1 ml/min, 25℃). 给予0.5 hz, 5 ms波宽的电场刺激, 场刺激由灌流小室底部两侧镶嵌的铂电极产生, 细胞收缩影像通过40×物镜传输到myocam照相系统并呈现在监视器上. 心肌细胞肌小节收缩幅度和收缩/舒张速度等指标由 计算 机自动实时采集并记录. 心室肌细胞选取标准: ① 细胞呈长杆状，长约为宽的6～8倍；② 细胞边缘折光性好，横纹清晰，细胞膜上无空泡且对台盼蓝拒染；③ 无自发收缩,而能随电刺激稳定地收缩；④ 细胞收缩方向与细胞长轴一致；⑤ 细胞进人灌流小室后，立即下沉并与小室底部很快粘附，灌流液在常规速度不能将其冲走；⑥ 给药前细胞收缩幅度恒定至少5 min以上［3］.
1.2.4 心肌细胞钙瞬变检测 将fura2/am(0.5 mol/l)与心肌细胞避光孵育30 min(25℃), 采用双激发荧光光电倍增系统检测荧光信号. 75 w紫外氙光灯发射的光通过360 nm或380 nm的滤光片到达0.5 hz刺激下收缩的心肌细胞, 细胞内与游离ca2+结合的荧光物质被激发, 其发射光在510 nm波长处被检测并通过光电倍增管记录. 细胞相继迅速被360 nm和380 nm激发光照射并交替扫描, 细胞内游离ca2+浓度的改变由上述两种波长荧光强度的比率所反映.
统计学处理：实验数据以x±s表示, 两组间均数比较采用组间t检验, 多组间均数比较采用方差 分析 (anova), 用origin 统计软件进行统计分析, p<0.05为差异具有统计学意义.
2 结果
2.1 心肌细胞模拟i/r模型 从12只大鼠心脏中的8个心脏分离出的心肌细胞较为理想, 并从中随机选取了10个形态、功能良好的心室肌细胞，建立心肌细胞的模拟i/r模型, 记录心肌细胞收缩变化时程(图1). 心肌细胞在电场刺激下以含氧台氏液灌流5 min, 待稳定后换以化学缺氧液灌流15 min模拟缺血, 肌小节收缩幅度逐渐减弱至缺血前的(30±8)% (n=10, p<0.05), 换以正常含氧台氏液再灌注, 心肌收缩很快恢复, 继续灌流细胞收缩逐渐稳定至缺血前的(85±9)%.
ap<0.05 vs缺血前(n=10).
2.2 rhuepo对模拟i/r心肌细胞收缩的 影响 再灌注时，给予rhuepo的i/r心肌细胞收缩速度和舒张速度明显加快，收缩幅度增加. 主要检测指标中最大收缩幅度(peak twitch amplitude，pta)、最大缩短速率(maximal velocity of shortening，+dl／dt)、最大复长速率(maximal velocity of relengthening，-dl／dt)均提高(表1, 图2).
2.3 rhuepo对模拟i/r心肌细胞钙瞬变的影响 再灌注后5 min，rhuepo增强心肌细胞收缩的同时, 心肌细胞钙瞬变也增强. 主要检测指标中δca2+荧光比率(fluorescence ratio, fr)提高，fura2荧光强度变化(ffi峰值ffi基线值，δffi) 没有显著差异，ca2+达峰值时程(time to peak ca2+，ttpca)、舒张期ca2+减少50％时程(time to 50% diastolic ca2+，t50dca) 减少(表2, 图3）.
ap<0.05，cp<0.05 vs对照组.
图2 正常组, i/r组, i/r+rhuepo组心肌细胞收缩幅度的变化（略）
ap<0.05，cp<0.05 vs对照.
