作者：柏干苹，周丽娜，贺伟峰，罗高兴，陈烯伟，陈光兴，胡晓红，石东文，方勇飞，吴军
【摘要】 目的：探讨正常人与类风湿关节炎(ra)患者滑膜成纤维细胞蛋白质组表达差异， 分析 差异蛋白在ra发病中的作用. 方法 ： 应用 固相ph梯度(ipg)双向凝胶电泳(2de)分离正常人及ra患者滑膜成纤维细胞总蛋白质；应用双向电泳凝胶分析软件（pdquest 7.3.1）对2de凝胶进行量化比较分析；应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定部分差异蛋白质，并用western blot、免疫细胞化学技术验证表达差异蛋白质. 结果：正常人及ra患者滑膜成纤维细胞蛋白2de凝胶图谱上分别平均显示896和992个点. 有64个蛋白质点表达存在2倍以上的差异. 选取9个在ra滑膜成纤维细胞中表达上调的蛋白质点进行质谱鉴定，成功鉴定出钙结合蛋白s100a4和s100a10两个蛋白质. 经western blot、免疫细胞化学技术验证这两个蛋白在ra滑膜成纤维细胞中表达上调，与上述结果一致，并且发现s100a4在ra滑膜成纤维细胞中的表达分布发生了变化. 结论：结合蛋白s100a4和s100a10可能参与ra的发病. s100a4在细胞中的表达易位可能与ra滑膜成纤维细胞表型改变有关.
【关键词】 滑膜成纤维细胞；蛋白质组；双向电泳；类风湿关节炎；s100a4基因；s100a10基因
【abstract】 aim: to find the differentially expressed proteins of synovial fibroblasts (sfs) from rheumatoid arthritis (ra) patients and normal controls using twodimensional gel electrophoresis (2de) and bioinformatics for providing useful and new clues to elucidate the pathogenesis and study the treatment of ra. methods: the total protein of sfs from either ra patients or normal ones was prepared by means of immobilized ph gradient based on 2de. gels were scanned, and the images were processed with pdquest 7.3.1 software. the differentiallly expressed proteins were identified by matrixassisted laser desorption ionizationtimeofflight mass spectrometry (malditofms). then some of them were validated by western blot and immunocytochemistry. results: 896 protein spots were detected in sfs of normal individuals, and 992 spots in ra, respectively. there were 64 different protein spots. a total of 9 protein spots that expressed at higher levels in sfs from ra were identified by malditofms, and 2 valid proteins were obtained. they were calcium binding protein s100a4 and s100a10. western blot and immunocytochemistry were used to further verify differentially expressed proteins. the results showed that expression levels of s100a4 and s100a10 were significantly higher in sfs from ra than in sfs from normal individuals. furthermore, the distribution of s100a4 in sfs was changed. conclusion: s100a4 and s100a10 might be involved in inflammation of synovitis in ra. these data will be used to elucidate the pathogenesis of ra for further study.
【keywords】 synovial fibroblasts; proteome; twodimensional electrophoresis; rheumatoid arthritis; s100a4; s100a10
0 引言
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, ra)是一种自身免疫性疾病，以非化脓性增生性滑膜炎为特点，逐渐导致关节软骨的破坏及关节功能的障碍. 近年来 研究 显示滑膜成纤维细胞在ra的发生、 发展 中发挥着t细胞依赖途径所不可解释的重要作用，从而引起了人们的重视［1-2］. 虽然滑膜成纤维细胞在关节炎中的作用已得到肯定，但其功能的分子机制仍不明确. 本研究利用高分辨双向电泳(twodimensional gel electrophoresis, 2de)对正常人及ra患者滑膜成纤维细胞进行蛋白质分离，筛选差异蛋白质，为探讨滑膜成纤维细胞在ra发病中的作用提供新的线索.
1 材料和方法
1.1 材料 人关节滑膜组织取自5例在重庆西南 医院 及新桥医院关节外科行关节置换术的ra患者及7例正常人外伤后行滑膜切除术者，12例患者均签署知情同意书，ra患者临床诊断均符合美国风湿病学会标准［3］. 固相ph梯度(immobilized ph gradient gel strip, ipg）干胶条(ph 3～10, 17 cm)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，3［(3胆胺酰丙基)二甲基氨基］1丙基磺酸酯（3［(3cholamidopropyl)dimethylammonio］1propanesulfonate, chaps），尿素，碘乙酰胺，二硫苏糖醇(dithiothreitol, dtt)，十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, sds)，两性电解质(pharmalyte, ph3-10),蛋白定量试剂盒，低熔点琼脂糖(美国biorad公司)；硫脲（美国sigma公司）；双向电泳系统（protein ief cell等电聚焦仪, protein ii xi cell垂直电泳槽, 校准型光密度仪gs800 calibrated densitometer，凝胶定量软件quantity one 4.5.0，双向电泳凝胶分析软件pdquest7.3.1）（美国biorad公司）. s100a4及s100a10抗体（美国santa cruz 公司），荧光化学发光成像系统chemidoc xrs（美国biorad公司）；免疫组化染色试剂盒(sp kit)（北京中衫生物技术公司）；其余试剂均为国产分析纯.
1.2 方法
1.2.1 滑膜成纤维细胞的培养 参照 文献 ［4］的方法进行滑膜成纤维细胞的原代培养. 术中取出滑膜组织，立即于无菌条件下剪碎，2.5 g/l胰蛋白酶37℃消化2 h后，离心收集细胞，加入含有200 ml/l胎牛血清dmem培养液，置于37℃ 50 ml/l co2孵箱中令其贴壁生长，细胞生长至85%满时，胰蛋白酶消化进行1∶2传代. 本实验中采用3～5代滑膜成纤维细胞.
1.2.2 细胞总蛋白质的制备［5］ 取3～5代培养滑膜细胞，待细胞生长至融合期时，吸出培养液，用胰酶消化，pbs液洗涤细胞3次后，加入细胞裂解液（尿素7 mol/l，硫脲2 mol/l，chaps 40 g/l，dtt 65 mmol/l，pharmalyte 2 g/l）充分混匀，14 000 g，4℃离心1 h，取上清，用bradford方法测定蛋白含量，并分装于-80℃冻存备用.
1.2.3 双向电泳 采用ph 3～10 nl ipg胶条进行2de分析. 按biorad双向电泳操作指南进行. 400 μg蛋白样品加入水化样品缓冲液(8 mol/l尿素，20 g/l chaps，ph 3～10的5 g/l ipg缓冲液，18 mmol/l dtt，0.02 g/l溴酚蓝)中溶胀后进行等电聚焦. 程序设置如下:250 v、线性、30 min；1000 v、快速、1 h；10 000 v、线性、3 h；10 000 v、快速、40 000 vh；500 v、快速、任意时间保持. 等电聚焦电泳后ipg胶条经平衡转移至1 mm厚的120 g/l sds聚丙烯酰胺凝胶上端进行第二向sdspage电泳.
1.2.4 银染及凝胶图像采集分析 sdspage胶按照文献［6］的方法进行硝酸银染色后，应用校准型光密度仪，凝胶定量软件进行扫描获取图像. 数字化图像文件运用双向电泳凝胶分析软件对图像进行分析，图像分析过程包括蛋白点的检测、量化、背景消减和点的匹配，进行强度校正、点检测、背景消减、匹配、1 d校正、建立平均凝胶分析等.
1.2.5 质谱鉴定 切割蛋白质点置于微量离心管中，经洗涤、脱色及进行胶内蛋白质酶解后，将从蛋白质差异点抽提所得的肽段通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（autoflex）进行分析，获取蛋白样品的肽质量指纹图，最后应用肽质量和碎片离子检索分析软件（mascot）在人类蛋白质公共数据库（ncbi、swissprot）中搜寻，获得蛋白质的相关信息.
1.2.6 western blot验证差异蛋白 将20 μg滑膜总蛋白加入2×sds上样缓冲液（0.1 mol/l tris ph 6.8, 0.2 mmol/l dtt,40 g/l sds,200 ml/l甘油，2 g/l溴酚蓝），100℃变性5 min，上样， 120 v 120 g/l sdspage电泳2 h，1 ma/cm2胶面积电转30 min. 含50 g/l脱脂奶粉的tbst室温封闭1 h，分别加入抗s100a4，s100a10抗体，4 ℃振荡孵育膜过夜. tbst洗膜10 min×3次. 加入hrp标记的二抗，室温1 h. tbst洗膜10 min×3次. 凝胶成像分析仪化学发光检测，扫描、保存、分析图像.
1.2.7 免疫细胞化学技术验证差异蛋白 制备正常及ra滑膜成纤维细胞爬片. 采用sp法检测s100a10和α平滑肌肌动蛋白(αsma). 染色程序按sp试剂盒说明书进行，每批染色均设立空白对照，以pbs液代替一抗. 免疫荧光细胞化学法检测s100a4. 用冷的甲醇固定，-20℃ 10 min； -20℃用冷的丙酮渗透1 min. 水洗后，一抗孵育，37℃孵育45 min. pbs冲洗5 min×3次， pbs稀释标记二抗1∶100，室温孵育30 min. pbs冲洗5 min×3次，甘油缓冲液（9份优质甘油加1份ph 7.4 pbs液）封片，并对染色后的细胞片进行显微镜下观察、摄片. 每张切片随机观察5个高倍视野，应用image pro plus 5.0图像分析系统进行处理，随机选场，自动采点分析，测得阳性细胞积分吸光度值, 分析比较s100a4，s100a10，αsma表达量的变化（积分吸光度值越高，表示阳性细胞区域越大或信号越强）.
2 结果
2.1 滑膜成纤维细胞蛋白质组图谱差异分析及差异蛋白鉴定 应用双向电泳,获得了重复性较好的滑膜成纤维细胞的双向电泳银染图谱(图1). 正常人及ra患者2de银染图谱上分别平均显示896,992个蛋白质点. 有64个蛋白点在正常、ra滑膜成纤维细胞间有2倍以上的显著性量变. 结合肉眼观察选取了9个表达差异点进行了malditofms，成功鉴定2个在ra滑膜成纤维细胞中表达上调的蛋白质钙结合蛋白s100a4,s100a10. 成功鉴定的蛋白质点在胶图中位置及名称如图1b所示，其名称及数据库检索相关信息见表1.
a： 正常滑膜成纤维细胞; b：ra滑膜成纤维细胞.
图1 滑膜成纤维细胞2de图谱（硝酸银染色，ph 3～10 nl）（略）
表1 正常人及ra患者滑膜成纤维细胞差异表达蛋白质信息（略）
2.2 s100a4, s100a10在滑膜成纤维细胞中的表达
2.2.1 s100a4在滑膜成纤维细胞中的表达 western blot结果显示s100a4蛋白在ra滑膜成纤维细胞中的表达显著升高,该结果与蛋白质组的检测结果一致（图2）. 光镜观察在正常滑膜成纤维细胞s100a4表达在细胞浆，但在ra滑膜成纤维细胞中其分布改变，在细胞浆和细胞核均可见荧光分布，且细胞核较强. ra滑膜成纤维细胞中的荧光明显强于正常滑膜成纤维细胞，图像 分析 系统显示s100a4在ra滑膜成纤维细胞中的表达明显高于正常滑膜成纤维细胞(图3).
2.2.2 s100a10在滑膜成纤维细胞中的表达 western blot结果显示s100a10蛋白在ra滑膜成纤维细胞中的表达显著升高（图2）. 光镜观察s100a10均分布在正常、ra滑膜成纤维细胞的细胞浆，细胞浆染成棕黄色，ra滑膜成纤维细胞中的染色明显深于正常滑膜成纤维细胞，图像分析系统显示s100a10在ra滑膜成纤维细胞中表达明显高于正常滑膜成纤维细胞(图4).
a： 正常滑膜成纤维细胞; b：ra滑膜成纤维细胞.
图2 s100a4和s100a10在正常和ra滑膜成纤维细胞中的表达（略）
a：正常滑膜成纤维细胞; b: ra滑膜成纤维细胞.
图3 s100a4在滑膜成纤维细胞中的表达 sp ×200（略）
2.3 αsma在滑膜成纤维细胞中的表达 光镜观察正常滑膜成纤维细胞中无αsma表达，ra滑膜成纤维细胞中约20％的细胞表达αsma，细胞浆染成棕黄色，且细胞由典型的长梭形变为扁平、不规则形，胞浆内充满纤细的与细胞长轴平行排列的肌微丝(图5).
a：正常滑膜成纤维细胞; b: ra滑膜成纤维细胞.
图4 s100a10在滑膜成纤维细胞中的表达 ×200（略）
图5 αsma在ra滑膜成纤维细胞中的表达 ×200（略）
3 讨论
ra滑膜成纤维细胞在细胞周期中增生异常活跃，呈肿瘤样增生，是造成软骨破坏的一个重要原因. 因此，阐明滑膜增生机制对指导临床 治疗 具有重要的临床意义.
s100a4, s100a10是钙结合蛋白s100家族成员,在ra的滑膜中已证实有s100蛋白的表达［7］，如s100a4，s100a8/9，s100a12以及本 研究 发现的s100a10. s100a4在肿瘤的形成及转移中的作用已毋庸置疑. 也有证据表明s100a4可能参与sf的进展性、侵袭性、肿瘤样的生长［8-9］，但未见其确切机制的报道. p53是s100a4的靶蛋白之一，野生型p53主要诱导细胞凋亡和促进分化，抑制肿瘤. ra滑膜成纤维细胞上可检测到大量的p53表达［10］，并且主要位于患者病变的滑膜成纤维样细胞上，但其中约40%的 p53 cdna克隆发生突变，因而不能对异常增生的滑膜成纤维细胞发挥有效的作用. 因此s100a4可能通过与p53相互作用的途径调节着滑膜细胞的异常增殖，参与sf的侵袭性生长. 另一方面，我们发现s100a4在细胞中的分布发生了变化. 其发生表达易位的原因还不清楚，根据 文献 报道［11］，在培养基中加入tgfβ，可使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞. 在这些分化的肌成纤维细胞中，s100a4主要表达在细胞核，本研究也发现约20％的滑膜成纤维细胞表达αsma，因此推测s100a4在ra滑膜细胞的表达分布变化可能与滑膜成纤维细胞的表型改变有关. s100a4在滑膜成纤维细胞的增殖及表型改变中的作用还需进一步的功能研究.
膜联蛋白（annexin ii）、磷脂酶a2（pla2）、纤溶酶原均为s100a10的相互作用蛋白，因此s100a10不仅可调节pla2的活性具抗炎作用，且可与纤溶酶原结合，调节纤溶酶活化作用. 体内、外研究均发现［12-13］，纤溶酶原激活因子（pa）在正常人以及ra、骨关节炎（oa）等炎症性关节病的软骨、滑膜、滑液及血浆中均有表达，且ra患者的滑膜组织中尿激酶型pa（upa）抗原浓度均明显高于正常人及oa滑膜组织，而组织型pa（tpa）抗原水平在不同患者则呈不同表现. 故s100a10, upa在ra中的表达明显高于正常人和其他炎症性关节疾病可能与ra的滑膜增殖在很多方面类似于局限侵袭性生长的肿瘤有关.
【 参考 文献】
［1］ morand ef, leech m. macrophage migration inhibitory factor in rheumatoid arthritis［j］. front biosci, 2005,10:12-22.
［2］ debusk lm, chen y, nishishita t, et al. tie2 receptor tyrosine kinase, a major mediator of tumor necrosis factor alphainduced angiogenesis in rheumatoid arthritis［j］. arthritis rheum, 2003,48(9): 2461-2471.
［3］ 中华医学会风湿病学分会. 类风湿关节炎诊治指南(草案) ［j］. 中华风湿病学杂志, 2003,7(4):250-254.
［4］ 孙铁铮,吕厚山,药立波,等. 染料木黄酮对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞生长的 影响 ［j］.中华风湿病学杂志,2000,4(5):266-269.
［5］ 彭双发,吴 军,殷剑宁,等. 人cd4+cd25+t细胞和cd4+cd25-t细胞蛋白质组的双向电泳分析［j］. 第三军医大学学报,2003,25(6):492-494.
［6］ yan jx, wait r, berkelman t, et al. a modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrixassisted laser desorption/ionization and electrospray ionizationmass spectrometry［j］. electrophoresis, 2000,21(17): 3666-3672.
［7］ senolt l, grigorian m, lukanidin e, et al. s100a4 (mts1): is there any relation to the pathogenesis of rheumatoid arthritis?［j］. autoimmun rev, 2006,5(2):129-131.
［8］ klingelhfer j, senolt l, baslund b, et al. upregulation of metastasispromoting s100a4 (mts1) in rheumatoid arthritis: putative involvement in the pathogenesis of rheumatoid arthritis［j］. arthritis rheum, 2007,56(3):779-789.
［9］ senolt l, grigorian m, lukanidin e, et al. s100a4 is expressed at site of invasion in rheumatoid arthritis synovium and modulates production of matrix metalloproteinases［j］. ann rheum dis, 2006, 65(12): 1645-1648.
［10］ salvador g, sanmarti r, garciapeiro a, et al. p53 expression in rheumatoid and psoriatic arthritis synovial tissue and association with joint damage［j］. ann rheum dis, 2005,64(2):183-187.
［11］ ryan dg, taliana l, sun l, et al. involvement of s100a4 in stromal fibroblasts of the regenerating cornea［j］. invest ophthalmol vis sci, 2003,44(10):4255-4262.
［12］ guiducci s, del rosso a, cinelli m, et al. raloxifene reduces urokinasetype plasminogen activatordependent proliferation of synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis［j］. arthritis res the r, 2005,7(6): 1244-1253.
［13］ 杨春花,黄 烽.类风湿关节炎中尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体蛋白和基因的表达［j］.中华风湿病学杂志,2000,4(3):159-161.
