【关键词】冠心病；一氧化氮合酶,内皮；基因

　　摘要： 目的   探讨内皮型一氧化氮合酶(enos)基因内含子4可变串联重复序列(vntr)多态性与早发冠心病的关系。方法   以医院为基础的病例对照研究，选择新诊断的冠心病患者为研究对象。男性≤55岁及女性≤65岁患冠心病为早发冠心病，以188例早发冠心病患者为病例组，315例迟发冠心病患者为对照组。应用聚合酶链反应(pcr)技术检测enos基因内含子4 vntr多态性。结果   enos基因内含子4 vntr c/c、c/b、b/b、b/a、a/a基因型频率，早发冠心病组分别为053%，000%，8138%，1649%，160%；迟发冠心病组分别是 000%，032%，7746%，2032%，190%。c/c+c/b+b/b与b/a+a/a基因型在2组之间分布差异无统计学意义(p=0268，or=1294，95%ci=0820～2043)。c、b、a等位基因频率，早发冠心病组分别是053%，8963%，984%；迟发冠心病组分别是016%，8778%，1206%。c+b与a的等位基因频率在2组间分布差异无统计学意义(p=0280，or=1257，95%ci=0830～1904)。在α=005显著性水平上，用多元逐步非条件logistic回归分析调整性别、吸烟、饮酒、收缩压、体质指数、腰臀比、甘油三酯和总胆固醇后，enos基因内含子4 vntr多态性与早发冠心病也无显著相关(p=0427, or=0819, 95%ci=0500～1341)。wWW.11665.coM结论   enos基因内含子4 vntr多态性可能不是早发冠心病发病的危险因素。

　　关键词： 冠心病；一氧化氮合酶，内皮；基因

　　association between polymorphism of endothelial nitric oxide synthase gene and coronary heart disease   

　　hu maohong，jia chongqi，liu tongtao，et al.

　　department of epidemiology and health statistics,school of public health,shandong university(jinan 250012,china)

　　abstract： objective   to assess the association between intron 4 vntr polymorphism in endothelial nitric oxide synthase (enos) gene and premature coronary heart disease(p-chd).methods   a hospital-based case-control study was conducted.newly-diagnosed chd patients were recruited as this study subjects.one hurdred and eighty-eight chd patients diagnosed at/before 55 years old for males and 65 for females were assigned to p-chd case group with other 315 chd patients as the control group.genotypes were detected by polymorphism chain reaction (pcr) technique.results   the genotype frequencies of c/c,c/b,b/b,b/a,a/a were 053%,000%,8138%,1649%,160% in p-chd group respectively and 000%,032%,7746%,2032%,190% in the control group respectively.there was no significant difference between the p-chd and the control group for comparing genotype frequencies of c/c+c/b+b/b with b/a+a/a (p=0268,or =1294,95%ci=0820～2043).the allele frequencies of c,b,a were 053%,8963%,984% in the p-chd group respectively and 016%,8778%,1206% in the control group respectively.there was also no significant difference between the p-chd and the control group for comparing allele frequencies of c+b with a (p=0280，or=1257，95%ci=0830～1904).stepwise multiple logistic regression analysis at 005 significant level with adjust ment of sex,smoking,alcohol drinking,systolic blood pressure,overweight,waist-hip ratio,serum triglyceride,serum total cholesterol covariates showed that the enos4a had no significant effect on p-chd (p=0427,or=0819,95%ci=0500～1341).conclusion   enos intron 4 a/b vntr polymorphism is not a risk factor for p-chd.

　　key words： coronary heart disease;nitric oxide synthase;endothelial;gene
      
　　遗传因素在冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病chd)发病中具有重要作用，但早发与迟发病例在遗传背景方面存在较大差异，其中，内皮型一氧化氮合酶(enos)基因对冠心病具有重要作用〔1〕。enos基因内含子4存在27bp的可变串联重复序列(vntr)，研究显示，这种多态性与机体一氧化氮(no)的代谢水平密切相关〔2〕。为探讨enos基因内含子4vntr多态性与早发冠心病之间的关系，本文对188例早发冠心病及315例迟发冠心病进行观察比较。结果报告如下。

　　1   对象与方法

　　11   对象   选择2002年6月～2005年6月山东大学附属医院心内科确诊的新发病例503例，均符合1979年who制定的关于缺血性心脏病的诊断标准〔3〕，以男性≤55岁及女性≤65岁患有冠心病者为早发冠心病。以早发冠心病188例为观察组，平均年龄(511±776)岁；迟发冠心病315例为对照组，平均年龄(697±802)岁。

　　12   方法

　　121   现场调查   (1)问卷调查：内容包括年龄、性别、既往病史、吸烟史和饮酒史；体检包括身高、体重、腰围、臀围、收缩压(sbp)和舒张压(dbp)；并按体重/身高2(kg/m2)计算体质指数(bmi)，按腰围/臀围计算腰臀比(whr)。(2)采集血样：抽取调查对象空腹肘静脉血5ml，其中1ml用乙二胺四乙酸二钠盐(edta)-na抗凝，用于基因组dna提取；4ml分离血清，用于血清学检测。(3)血清生化指标检测：血清甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)用酶法测定，试剂盒由(北京中生生物工程高技术公司。)

　　122   基因组

dna提取   用十二烷基硫酸钠(sds)及蛋白酶k消化，酚/氯仿提纯，乙醇沉淀。

　　123   enos基因内含子4 vntr多态性检测   以提取的dna为模板，根据设计的上、下游引物，用pcr方法特异性扩增含有可变串联重复序列的片段。引物序列，上游5′-ctcagcccagtagtgaagac-3′；下游5′-gcttctcttagtgctgtggt-3′。pcr反应体系总体积为30μl，其中含模板100ng，引物各03μmol/l，50mmol/l kcl，15mmol/l mgcl2，10mmol/l tris-hcl (ph=84)，015mmol/l dntps，15u ex taq dna聚合酶(takara)。反应条件为95℃预变性5min，33个循环中95℃变性45s，58℃退火60s，72℃延伸45s，最后72℃延伸5min。pcr产物用8%的聚苯烯酰胺电泳，银染色观察实验结果。根据片段数量与长度进行基因型分析。

　　13   统计分析   用spss 115及stata 82软件进行分析，计数资料用χ2检验；计量资料用两样本均数比较的t检验；多因素分析用多元逐步非条件logistic回归。

　　2   结果

　　21   一般情况   (1)早发冠心病组男性104例，女性84例，性别比为124∶1；迟发冠心病组男性221例，女性94例，性别比为235∶1。早发冠心病组吸烟者73例，吸烟率为388%；迟发冠心病组吸烟者92例，吸烟率为292%。早发冠心病组饮酒者44例，饮酒率为234%；迟发冠心病组饮酒者45例，饮酒率为143%。其中性别比、吸烟率、饮酒率等差异均有统计学意义(p<005或p<001)。(2)2组检测指标比较：早发冠心病组收缩压/舒张压分别为(12747±1810)/(7922±1100)mmhg；迟发冠心病组为(13151±2339)/(7759±1284)mmhg。早发冠心病组体质指数为(2632±316)kg/m2，迟发冠心病组为(2496±369)kg/m2。早发冠心病组腰臀比为090±007，迟发冠心病组为088±007。早发冠心病组血清甘油三酯为(202±132)mmol/l，迟发冠心病组为(156±094)mmol/l。早发冠心病组胆固醇含量为(539±111)mmol/l，迟发冠心病组为(517±116)mmol/l。2组的收缩压、体质指数、腰臀比、血清甘油三酯和胆固醇含量等差异均有统计学意义(p<005或p<001)。

　　22   enos基因内含子4 vntr基因型及等位基因频率分布(表1)   (1)将enos基因内含子4 的vntr多态性按不同等位基因分析，4次串联重复序列等位基因记为enos4a；5次串联重复序列野生型等位基因记为enos4b；6次串联重复序列等位基因记为enos4c。pcr结果显示，共扩增出5种基因型，其中：a/a片段长度为425bp；b/a 2个片段长度分别为452和425bp；b/b片段长度为452bp；c/b 2个片段长度分别为479和452bp；c/c片段长度为479bp。(2)为观察enos4a基因型与冠心病的相关性，将enos4a与enos4b及enos4c进行基因型与等位基因频率分析。结果可见，c/c+c/b+b/b(合并后的频数与频率，早发冠心病组为154与8191%；迟发冠心病组为245与7778%)，与b/a+a/a(合并后的频数与频率，早发冠心病组为34与1809%；迟发冠心病组为70与2222%)，经比较，χ2=1229，p=0268，or=1294，95%ci=0820～2043；c+b(合并后的频数与频率，早发冠心病组为339与9016%；迟发冠心病组为554与8794%)与a(频数与频率，早发冠心病组为37与984%；迟发冠心病组为76与1206%)，经比较，χ2=1167，p=0280，or=1257，95%ci=0830～1904，差异均无统计学意义。

　　表1   enos基因内含子4 vntr基因型及等位基因频率（略）

　　23   enos基因内含子4 vntr多态性与早发冠心病关系多因素分析(表2)   在α＝005显著性水平上，用多元逐步非条件logistic回归筛选性别、吸烟、饮酒、收缩压、bmi、whr、甘油三酯、总胆固醇等有显著影响的可能混杂因素，并将enos基因内含子4 vntr纳入模型，以探讨在控制可能的混杂因素后enos基因内含子4 vntr多态性的效应。表2可见，enos基因内含子4 vntr多态性与早发冠心病无显著性相关。

　　表2   enos基因内含子4 vntr多态性与早发冠心病关系的多元logistic回归分析（略）

　　注：vntr：c/c+c/b+b/b与b/a+a/a比较；bmi≥240为1

　　3   讨论

　　目前，虽然国内外对enos4a/b vntr多态性与冠心病之间的关系研究较多，但结果相差甚远。有资料认为〔4,5〕，enos4a 等位基因能显著升高冠心病的发病危险性。有研究表明〔6〕，enos4a/b vntr多态性与冠心病无显著性相关，但有资料显示〔7〕，enos4a 等位基因对冠心病的发病具有显著的保护性作用。尽管导致现有资料结果相互矛盾的原因众多，但各研究所选研究对象年龄的不同可能是其原因之一，因为早发冠心病与迟发冠心病在遗传背景方面存在巨大差异。lee等研究显示〔5〕，只有在年龄＜51岁的人群中，enos4a/b vntr多态性与冠心病之间的关系才具有显著性。本研究结果显示，无论单因素分析还是多因素分析调整潜在的混杂因素后，enos4a/b vntr多态性与早发冠心病之间均无显著性相关。唐欧杉等〔8〕选择年龄匹配的健康者作为对照组，结果显示，enos4a/b vntr多态性与早发冠心病之间也无显著性相关，与本研究结果一致。关于enos4a/b vntr多态性是否引起enos的功能改变目前尚无定论。虽然有资料显示〔2〕，enos4a 基因携带者血浆no水平显著降低，但是enos4a等位基因与enos基因t-786c变异存在显著的连锁不平衡〔9〕，而enos基因t-786c变异能显著降低enos基因启动子

活性〔10〕。因此，关于enos4a/b vntr多态性仅仅是一个遗传标记，还是与冠心病发生相关的因素，以及其与冠心病之间的关系如何尚须进一步深入研究。

　　参考文献

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　　〔2〕   tsukada t,yokoyama k,arai t,et al.evidence of association of the ecnos gene polymorphism with plasma no metabolite levels in humans［j］.biochem biophys res commun,1998,7,245:190-193.

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　　〔7〕   park kw,you kh,oh s,et al.association of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene polymorphism with acute coronary syndrome in koreans［j］.heart,2004,90:282-285.

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　　(孔繁学编辑   刘铁校对)

　　*基金项目： 山东省卫生厅科研基金资助项目（hz036）
   
　　作者单位： 山东大学流行病与卫生统计学研究所, 济南 250012; 山东大学齐鲁医院心内科