内皮抑素和胶原ⅹⅷ在大鼠心肌梗死后心肌的表达
【关键词】 缺血心肌;内皮抑素;胶原ⅹⅷ
【摘要】 目的 探讨内皮抑素和胶原ⅹⅷ在急性心肌缺血后的表达。方法 采用心肌梗死大鼠作为心肌缺血动物模型，心肌梗死大鼠分别在术后第7、14、21、28天处死，留取梗死边缘存活心肌，采用elisa和rtpcr技术检测缺血心肌中内皮抑素和胶原ⅹⅷ水平，采用免疫组织化学方法测定内皮抑素在心肌内的分布。结果 与对照组比较，内皮抑素和胶原ⅹⅷ在梗死7 d后表达明显增加，至28 d缺血心肌内仍有内皮抑素和胶原ⅹⅷ的表达。免疫组化显示内皮抑素弥散分布于血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞。结论 内皮抑素和胶原ⅹⅷ在心肌梗死后缺血心肌内的表达提示内皮抑素和胶原ⅹⅷ在心肌损伤后心肌内血管新生和冠脉侧支循环形成方面起重要的负性调节作用。
【关键词】 缺血心肌;内皮抑素;胶原ⅹⅷ
【abstract】 objective to explore the expressions of endostatin and collagen ⅹⅷ in infarcted myocardium in the rat. methods myocardial infarction (mi) rats were made and killed at 7, 14, 21 and 28 days after mi. survival myocardium on the edge of mi was reserved. expressions of collagen ⅹⅷ and endostatin were assessed by rtpcr and elisa. expression of endostatin protein in mi was also assessed by immunohistochemistry. results to compared with control, both collagen ⅹⅷ mrna and endostatin increased at 7 days after mi, and there were the expressions of collagen ⅹⅷ and endostatin at 28 days in ischemic myocardium. endostatin protein localized at vascular endothelium, smooth muscle and myocytes. conclusions expressions of endostatin and collagen ⅹⅷ after mi play a negative modulation role in the coronary collaterals formation and myocardial angiogenesis after mi.
【key words】 ischemic myocardium; endostatin; collagen ⅹⅷ
缺血性心脏病是危害人类健康的主要疾病之一，侧支循环的建立能够缩小心肌梗死面积、改善心功能、增加缺血心肌再灌注。Www.11665.CoM冠脉血管新生和侧支循环形成障碍是影响缺血性心脏病患者预后的主要因素。侧支循环的建立依赖于两个方面，一是由于血管的阻塞导致压力的增加使已经存在的血管桥开放;另一方面是由于慢性缺血诱发的血管新生。促进冠脉血管新生建立丰富的侧支循环是改善冠心病患者预后的重要方法。血管新生是由促血管生成因子和抑血管生成因子共同调控的，内皮抑素是位于血管内皮的胶原ⅹⅷ分解而来的一个内源性抑血管新生因子，特异性抑制内皮细胞的增殖、迁移，并诱导内皮细胞凋亡，其作用受体和信号传递机制尚未十分明确。临床研究表明内皮抑素水平与冠脉侧支循环水平呈负相关〔1，2〕，内皮抑素在缺血心肌中的表达情况尚未见报道，本实验观察缺血心肌中内皮抑素和胶原ⅹⅷ水平的变化。
1 材料与方法
1.1 心肌梗死模型的复制
复旦大学上海医学院实验动物中心提供的sd雄性大鼠(250～300 g)，以3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)，腹腔注射麻醉，用无创性缝线结扎左侧冠状动脉前降支制作心肌梗死模型，以结扎部位以下心肌变白搏动减弱且心电图出现st段弓背向上明显抬高为造模成功。假手术组除未结扎冠状动脉之外，处理同心肌梗死组。存活24 h以上的梗死组大鼠随机分组并分别于第7、14、21和28天处死。采用苏木素伊红染色评价左心室梗死面积，梗死面积小于20%大鼠从实验中剔除。留取梗死区边缘心肌-80℃保存用于elisa和rtpcr检测，10%甲醛固定用于免疫组织化学(sp)法检测。
1.2 方法
1.2.1 内皮抑素的免疫组织化学检测
切片脱蜡至水，按sp试剂盒说明操作，首先加入大鼠内皮抑素抗体〔1∶100磷酸盐缓冲液(pbs)稀释，美国biotechnology公司〕，血管内皮生长因子(vegf)抗体(1∶75 pbs 稀释，美国santa cruz 公司)， cd34抗体(1∶50 pbs稀释，美国santa cruz公司)，以pbs代替一抗作阴性对照，4℃孵育24 h，加入envision二抗，二氨基联苯胺(dab)显色。阳性产物为棕黄色或棕褐色，背景为紫蓝色，以细胞胞质或间质出现棕黄色或棕褐色，且着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。
1.2.2 胶原ⅹⅷ mrna 的表达
内皮抑素总rna的提取，按照trizol试剂盒方法。胶原ⅹⅷ mrna表达采用rtpcr方法检测。采用标准的逆转录体系合成cdna，然后用tag聚合酶链式反应体系进行扩增。应用oligo 软件辅助设计胶原ⅹⅷ的引物，序列，上游：5′ggtgcacaccaagaagtgaa3′,下游：5′ctcgaagcaaaccagaggac3′，预计扩增产物长度为393 bp，内参照gapdh的引物序列为：上游：5′gatgctggtgctgagtatgacg3′，下游：5′gtggtgcaggatgcattgctctga3′， 预计扩增产物长度为 200 bp(上海申友生物工程公司合成)。rtpcr产物电泳分析采用凝胶成像分析系统，检测各扩增条带的产物含量(条带灰度值=强度×面积)，胶原ⅹⅷ mrna的相对含量为(胶原ⅹⅷ的灰度值/gapdh的灰度值)×100%。
1.2.3 内皮抑素水平的检测
采用elisa法检测梗死边缘缺血心肌中内皮抑素的水平。将心肌组织加入裂解液，匀浆、离心弃组织碎屑。按内皮抑素elisa试剂盒(美国rapidbio lab公司)的说明书测定内皮抑素含量。分析仪器为spectramax250 全自动酶标仪(波长为450～690 nm，美国 sigma 公司产品)，具体方法按操作说明书进行。
1.3 统计学处理
采用spss11.5统计软件进行分析，实验数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验。
2 结 果
2.1 内皮抑素的表达
心肌梗死区周围的缺血心肌中存在内皮抑素的表达，内皮抑素不仅分布于心肌细胞，还分布于大小血管内皮和血管平滑肌细胞;梗死大鼠在第7天的缺血心肌中水平明显升高，随着时间的延长内皮抑素的水平逐渐降低，至28 d基本降至对照组水平。见图1，表1。图1 各组梗死心肌中内皮抑素表达表1 各组内皮抑素表达的elisa检测结果及胶原ⅹⅷ mrna表达
2.2 胶原ⅹⅷ mrna的表达
在梗死大鼠缺血心肌中胶原ⅹⅷ mrna的表达量明显增加，其表达量也是在第7天最高，至第28天仍略高于对照组正常心肌。见图2，表1。图2 各组胶原ⅹⅷ mrna的表达
3 讨 论
血管新生是心肌缺血的代偿性反应。大量的研究证明心肌梗死会增加vegf等促血管生长因子的表达，从而有助于增加心肌供血，改善预后。但研究表明反复缺血心肌中血管新生的程度并不与vegf水平的持续增加保持一致〔3〕。研究表明血管新生受促血管生长因子和抑血管生长因子共同调控。内皮抑素是重要的内源性抑血管生长因子，由基质金属蛋白酶、弹性蛋白酶等水解胶原ⅹⅷ产生，不仅能够特异性抑制内皮细胞的增殖、迁移，还能够抑制vegf、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)所诱导的内皮细胞增殖、迁移〔4〕。panchal等发现冠心病患者侧支循环水平不完全依赖于vegf的持续升高，而与心包液中内皮抑素的水平相关，侧支循环水平高的患者内皮抑素的水平大约低40%〔1〕，seko等报道急性心肌梗死患者的外周循环血液中内皮抑素水平升高，再灌注后明显降低，与vegf的变化一致〔2〕，提示内皮抑素可能是反映心肌缺血的指标。本实验则进一步证实内皮抑素及其前体胶原ⅹⅷ在心肌梗死后缺血心肌中表达增加，在早期水平最高，至第28天仍有持续表达，与vegf的表达变化趋势相似，表明内皮抑素与vegf共同参与缺血心肌血管新生的调节。由于内皮抑素具有较强的抑制血管新生作用，极少量的内皮抑素就可以抑制较大量的vegf、bfgf的促内皮细胞增殖、迁移作用〔4〕。而急性心肌缺氧后表现为血管新生增加，可能与促血管生长因子和抑血管生长因子之间的平衡处于正平衡有关，直至二者之间达到平衡状态血管新生作用终止。诸多因素均可以影响二者之间的平衡，例如内皮功能降低、大剂量他汀类药物治疗均可以增加抑血管生长因子血管抑素、内皮抑素的表达〔5，6〕，所以内皮抑素在缺血心肌中的表达及其抑制血管新生作用不容忽视。
胶原ⅹⅷ是主要存在于血管壁和基底膜的胶原蛋白，也是内皮抑素的前体物质，在血管新生中也起一定的调节作用，胶原ⅹⅷ的基因缺陷，会导致内皮抑素产生减少而增加动脉粥样斑块和移植血管的血管新生作用〔7〕。心肌梗死后胶原ⅹⅷ基因的表达可以部分解释内皮抑素的表达增加。
本研究提示内皮抑素也是心肌缺血的标志，抑制内皮抑素的产生可能会促进缺血心肌的血管新生和冠脉侧支循环的形成，但有关内皮抑素及胶原ⅹⅷ在缺血心肌血管新生过程中的作用尚需进一步研究。
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