丹酚酸b对离体培养内皮祖细胞vegf、bfgf mrna表达及抗氧化酶活性的影响
【关键词】 丹酚酸b;内皮祖细胞;细胞因子;抗氧化酶
【摘要】 目的 探讨中药单体丹酚酸b对离体培养内皮祖细胞(epcs)细胞因子mrna表达及抗氧化酶活性的影响。方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化epcs，免疫细胞化学法鉴定。选择丹酚酸b最佳药物浓度干预的epcs，采用实时荧光定量pcr(rtpcr)检测细胞vegf,bfgf mrna表达，测定细胞培养液抗氧化酶sod,gshpx的活性。结果 丹酚酸b组vegf，bfgf mrna的表达量增加，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。丹酚酸b组细胞培养液中sod活性增强，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05);gshpx活性有增强趋势，但与对照组比较差异无显著性(p>0.05)。 结论 丹酚酸b对epcs具有保护作用，增强其细胞功能的部分机制与其增强分泌细胞因子vegf和bfgf mrna的表达，并且促进细胞释放sod、gshpx，清除自由基能力增强有关。
【关键词】 丹酚酸b;内皮祖细胞;细胞因子;抗氧化酶
【abstract】 objective to explore the effects of traditional chinese medicine monomer sal b on cytokine mrna expression and activity of antioxidant enzymes of endothelial progenitor cells (epcs) in vitro. methods cultivation and purification of epcs in vitro was by densitygradient centrifugation and plastic adherence method，and identified by immunocytochemistry. epcs were intervened by best concentration of sal b, the expressions of vegf, bfgf mrna were detected by rtpcr, the activity of antioxidant enzymes sod, gshpx activity of cell culture fluid were tested. results vegf, bfgf mrna expression of sal b group were increased, which had statistically significant difference compared with those of control group (p<0.05). sod activity was enhanced of sal b group, which had statistically significant difference compared with that of control group (p<0.05). sal b group strengthened the trend of the activity of gshpx , but there was no significant difference compared with that of control group (p>0.05). conclusions sal b plays a protective role and enhances its cell function on epcs, the part of the mechanism is that enhances the expressions of vegf,bfgf mrna, promotes the cells to release sod, gshpx, and enhances the scavenging capacity of free radical.
【key words】 sal b; endothelial progenitor cell; cell factor; antioxidant enzymes
内皮祖细胞(epcs)是血管内皮的前体细胞，参与成体血管新生，是治疗缺血性疾病和改善微环境的良好种子细胞，具有广阔的应用前景〔1〕。wWw.11665.cOM前期研究显示活血化瘀中药丹参的主要水溶性成分丹酚酸b(sal b)对epcs具有保护作用，增强其细胞功能〔2〕。本文从细胞因子血管内皮生长因子(vegf)和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)mrna表达和抗氧化酶超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gshpx)入手，观察sal b对离体培养epcs细胞因子mrna表达及抗氧化酶活性的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
wistar大鼠，雄性，体质量(120±20) g(中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk20050001)。
1.2 主要仪器和试剂
ldmem;特级胎牛血清;vegf，bfgf，纤维连接蛋白(r&d);大鼠单个核细胞分离液(天津灏洋生物);cd34兔多克隆抗体，cd133兔多克隆抗体;sal b(天津天士力现代中药资源有限公司，批号20060601)。免疫细胞试剂盒(天津灏阳生物)，二氨基联苯胺(dab)(sigma公司);二苯基四氮唑溴盐(mtt)(联星生物)，taqman reverse transcription reagents和sybr green pcr master mix reagent kits试剂盒(applied biosystems)，trizol总rna提取试剂(天津润泰科技发展有限公司);sod、gshpx生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
co2恒温培养箱(model tc2323 co2 incubator);倒置相差显微镜(xd101 98010)，超净化工作台(hitachi)，台式高速低温离心机(hermlez323k美国)， uv530紫外分光光度计(上海生物仪器厂)，pcr仪(美国hybaid)，abi7300实时定量pcr仪，细胞培养管(ep管);半自动生化仪(rt9200，成都贝斯达仪器有限公司);hh6数显恒温水浴锅;离心机(ldz52);酶标仪(美国biorad);无菌手术器械;磁力搅拌器;电子天平(bs1101s 德国)。
1.3 方法
1.3.1 epcs培养与鉴定
采用贴壁筛选和密度梯度离心结合法〔1〕：大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，dhank液冲洗骨髓，筛网过滤，制成单细胞悬液，按等比例缓慢滴加悬液于大鼠单个核细胞分离液(密度为1.080 g/ml)之上，2 000 r/min，离心15 min，抽取灰白色的单个核细胞层，用dhank′s离心洗涤后，以2.0×105/cm2的密度接种纤维连接蛋白(5 μg/cm2)在包被的培养瓶中，ldmem(含体积分数为15%胎牛血清，15% vegf，15% bfgf)，置于37℃，5%co2饱和湿度的培养箱中，4 d后首次换液，继续培养至第7天。选取生长良好的细胞培养至7 d的epcs，用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(sabc)法检测细胞表面抗原cd34、cd133。cd34、cd133定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。
1.3.2 mtt方法检测sal b的最佳药物浓
度 根据文献报道设立0，0.5，1，2，4，8，16，32，64 μg/ml药物浓度，分别测定细胞的od值，根据od值均数曲线图确定sal b的最佳药物浓度。
1.3.3 实验分组
细胞培养第7天后，以0.25%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液，以等数量细胞接种于12孔板，随机分为2组：①对照组：ldmem培养液(含15%胎牛血清、15%vegf，15% bfgf); ②实验组：ldmem培养液加入筛选出最佳浓度的sal b，培养24 h，进行检测。
1.3.4 实时荧光定量pcr(rtpcr)检测细胞vegf,bfgf mrna表达
1.3.4.1 细胞总rna提取
①按试剂盒操作说明，直接将裂解液trizol加入12孔板，每孔1 ml，每组设6个复孔，分别用加样器反复吹打几次，混匀;②将匀浆样品在室温放置10 min，使核酸蛋白复合物完全分解，吸取匀浆样品放于1.5 ml无rnase的离心管中;③每个离心管中加入0.2 ml氯仿，涡旋混合器剧烈震荡15 s，室温放置3 min，令样品萃取分层; ④4℃，12 000 r/min，离心15 min，样品分为三层黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，rna主要存在于水相中，将上清水相转移到预冷新管中，约500～600 μl;⑤每管缓慢加入与上清等量的冷异丙醇(-20℃预冷)，轻轻混匀，于-20℃静置2 h，使核酸沉淀;⑥4℃，12 000 r/min，离心10 min，弃上清，在管侧壁和管底形成白色胶状沉淀(rna);⑦缓慢沿管壁加入1.2 ml 75%乙醇(depc水配置)，洗涤沉淀，4℃，8 000 r/min，离心10 min，弃上清，剩余液体短暂离心，然后用枪头吸出，将沉淀室温放置2～3 min晾干，每管加入35 μl rnase free ddh2o，轻轻吹打数次，溶解rna，分装，备用。
1.3.4.2 总rna纯度、浓度测定及完整性检验
取1 μl总rna样品，加入到99 μl去离子水的比色皿中，混匀后紫外分光光度计测定od260、od280以及二者比值。od260/od280比值应在1.8～2.0范围，以此衡量rna纯度。根据公式“od260×40 μg/ml×稀释倍数/1 000”计算总rna浓度。
另取总rna 4.5 μl与0.5 μl上样缓冲液混合进行1%琼脂糖凝胶电泳，应用bio imaging system拍照，于凝胶成像系统中观察电泳结果，以出现28 s、18 s和5 s三条带确定rna的完整性。
1.3.4.3 cdna合成
根据试剂盒说明确定反应体系如下：总反应体系10 μl，10×taq man rt buffer 1.0 μl;25 mmol/l mgcl2 2.2 μl;deoxyntps mixture 2.0 μl;random hexamersb 0.5 μl;rnase inhibitor 0.2 μl;multiscribetm reverse transcriptase 0.25 μl;样品总rna 0.2 μg;反转录反应条件：70℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min，终止反应。
1.3.4.4 目的基因vegf,bfgf及内参照基因βactin扩增 ①pcr扩增：在pcr仪中，bfgf、vegf反应条件为：94℃ 5 min预变性后;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共32个循环;再于72℃延伸7 min。各目的基因及内参照基因特异性引物序列，βactin反应条件为：94℃ 5 min预变性后;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共28个循环;再于72℃延伸7 min。总反应体系为50 μl，包括cdna 3 μl，1 mmol/l dntps 10 μl，10×taq聚合酶buffer 5 μl，目的基因和βactin上下游引物各2 μl(10 pmol/l),mg2+3 μl，去离子水24 μl，taq酶1 μl。引物序列见表1。②所得ct值经转换后以2-δδct相对定量法获得每个样本各目的基因相对表达量数值。表1 各目的基因及内参照基因引物序列
1.3.5 细胞培养液抗氧化酶的测定
两组epcs培养于12孔板中，培养条件同前，7 d后收集培养液，每组取6孔样本，2 000 r/min，离心10 min，取上清，比色分析法测定培养液sod和gshpx活性，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。
1.4 统计学分析
使用spss11.5统计软件，数据以x±s表示，采用两独立样本t检验。
2 结 果
2.1 sal b最佳药物浓度
确定sal b的最佳药物浓度为8 μg/ml，此剂量可使细胞生长状态最佳，细胞活力最强。见表2。表2 不同浓度sal b作用于epcs后细胞的吸光度值
2.2 sal b对epcs vegf,bfgf mrna表达的影响
sal b组vegf，bfgf mrna的表达量增加，与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。见表3。表3 两组vegf,bfgf mrna相对表达量的比较
2.3 sal b对epcs培养液sod,gshpx活性的影响
sal b组细胞培养液中sod活性增强，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05);而gshpx活性有增强趋势，但与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。见表4。表4 两组细胞培养液sod,gshpx活性的比较
3 讨 论
epc可在生理和病理状态下被招募到目的部位，通过血管生成和血管形成机制分化为血管内皮细胞，从而更新和修复衰老或受损的内皮细胞。在机体缺血、组织损伤和细胞因子(或药物)刺激下，epc可从骨髓向靶部位动员、分化及增生，形成新生血管〔3〕。外周血循环中epcs的数量与功能决定着损伤血管的内皮修复程度。
vegf刺激内皮增殖、增强血管通透性,bfgf刺激内皮细胞、smc和成纤维细胞增生,二者作为血管内皮细胞生长刺激因子,可以协同特异性地作用于血管内皮细胞,刺激其增殖,促进侧支血管的形成，从而改善组织器官的血液供应，对抗组织缺血〔4～6〕。在保护细胞免受或减轻活性氧损伤的过程中,细胞内sod和gshpx等具有抗氧化酶的作用〔7〕。氧化应激能引起epcs数量减少和功能减弱。虽然epcs存在抗氧化酶系统,但是当细胞正常的氧化还原稳态失衡时,ros过度产生而聚积,引起氧化应激,使dna、蛋白质、碳水化合物和脂质等生物大分子被氧化,导致细胞的衰老和凋亡〔8〕。丹参是活血化瘀中药，具有活血通经功效，其主要水溶性成分sal b可促进恢复受损内皮的功能，在治疗心血管疾病等方面发挥着重要作用〔9〕。研究显示最佳药物浓度的sal b(8 μg/ml)作用于epcs提高了其分泌细胞因子vegf和bfgf mrna的表达，并且促进了细胞释放sod，gshpx，清除自由基能力增强，说明sal b具有抗氧化损伤的作用，对epc具有保护作用，增强其细胞功能的部分机制与此相关。同时该实验结果也可为体外扩增epcs而进行在体实验提供了依据。
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