【摘要】 目的：探讨骨髓基质细胞(bmscs)结合血管内皮生长因子(vegf)基因心内膜注射治疗猪慢性心肌缺血模型的疗效。方法：建立猪心肌梗塞模型，胸骨穿刺抽取骨髓，分离培养bmscs，将vegf165基因转染到bmscs中，4周后进行左室心内膜电机械标测并行心内膜注射等操作，按照注射成分不同分为3组，联合组(n=8)注射转染vegf165基因的bmscs，细胞组(n=8)注射bmscs，对照组(n=6)注射生理盐水。于细胞移植后4周分别进行左室心内膜电机械标测、选择性冠脉造影及超声心动图检查。结果：术后4周时联合组较细胞组及对照组的心梗面积明显缩小，侧支循环、心脏泵血功能以及心肌收缩力改善更加明显(p<0.05～<0.01)。结论：自体bmscs结合vegf165基因治疗心肌梗塞效果显著。
【关键词】 心肌梗塞;间质细胞;血管内皮生长因子类;移植
efficacy of transplantation of vascular endothelial growth factorexpressing bone marrow stromal cells into ischemic swine myocardium/ yi fu，guo wenyi，l anlin，wang haichang，li hu，li weijie，liu bing，zhang dianxin，cheng hexiang，li fei，zhao zhijing，jia guoliang//chinese journal of cardiovascular rehabilitation medicine，2009，18(4):325
abstract：objective:to evaluate the efficacy of transplantation of vascular endothelial growth factor(vegf)-expressing bone marrow stromal cells(bmscs)into ischemic swine myocardium.methods:a swine model of chronic myocardial ischemia was made in this study. bmscs were obtained from swines′ breastbone marrow and cultured in vitro, then bmscs were transfected with the human vegf165 gene. four weeks later, vegf-expressing bmscs ( combo group, n=8), bmscs (bmscs control group, n=8) or saline water only (control group, n=6) was injected into swine hearts using left ventricular electromechanical (noga) mapping system and injection catheter. noga mapping, coronary angiography and echocardiography were conducted before and 4 weeks after cell transplantation.results:four weeks after cell transplantation, combination therapy resulted in superior improvement in all indexes of perfusion and function (contain myocardial infarction area, collateral circulation lvef etc.)compared with other two treatment groups(p<0.05～<0.01). conclusion:this combined strategy of cell transplantation with gene therapy could be of importance for the treatment of myocardial infarction.
key words：myocardial infarction; myeloid progenitor cells; vascular endothelial growth factors; transplantation
骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，bmscs)自体移植技术以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)的基因搭桥技术是治疗心肌梗塞(mi)的新手段，许多研究已经证实两种治疗方法的安全性和有效性[1～4]，但他们各有不足之处。Www.11665.COmvegf并不能挽救疤痕区的心肌，对于已经凋亡和变性的心肌细胞无法逆转，而bmscs移植，缺血缺氧使得移植细胞的存活率减低，从而影响疗效。同时，bmscs和vegf都具有促进血管新生的功能，将两种治疗方法联合应用是否可以弥补两者各自的不足，加大对缺血心肌血运改善的力度。本研究采用猪慢性mi模型，应用左室心内膜电机械标测系统及noga注射导管，观察bmscs结合vegf165心内膜心肌内注射对mi的疗效，来验证这种假设是否成立。
1 资料与方法
1.1 动物模型的建立
选取体重为50～65kg的家猪，平均(54.6±6.9)kg，雌雄不拘(由第四军医大学实验动物中心提供)。按照文献[5]的方法应用monorail球囊导管将海绵颗粒栓堵于前降支中段，10 min后回撤球囊导管，再次造影证实目标血管血流timi分级为0级，猪心梗模型建立成功。实验动物分成三组：联合组(n=8)注射转染vegf基因的bmscs;细胞组(n=8)注射bmscs;对照组(n=6)注射生理盐水。
1.2 bmscs的获取、培养及基因转染
采取胸骨骨髓20 ml，参见文献[6]的方法分离培养bmscs，传至第3代，联合组bmscs应用阳离子脂质体(lipofect amine,gibcobrl)转染vegf165质粒(本室合成[7])。术日晨，以胰蛋白酶消化各组细胞，计数，制成细胞悬液(8×107 ml)，备用。
1.3 左室心内膜电机械标测及细胞移植
模型建造后(细胞移植前)，采用noga电机械标测系统(cordis 公司)行左室心内膜电机械标测(有关noga系统的简介及标测方法详见文献[8])，可见心尖和/或部分左心室前壁出现了局灶性电压(红-黄区域)及机械运动度(红-黄区域)的减低，选取红-黄色交界区域(梗塞区周围)为注射部位，应用noga注射导管(myostar，cordis公司)在缺血坏死区周围选取注射点，均匀地将细胞注入，平均间隔约1 cm左右。细胞移植后4周再行左室心内膜电机械标测。
1.4 选择性冠脉造影
应用judkins法于细胞移植后4周进行选择性左冠脉造影，结果由两名有经验的介入医师进行侧支循环分级，分级方法采用rentrop评分标准。
1.5 超声心动图检查
采用sonos 5500型超声心动图机于细胞移植前及移植后4周进行超声心动图扫描，具体测定指标为：左心室射血分数(lvef)，左心室短轴缩短率(lvfs)，左室前侧壁增厚率(δt%)。
1.6 统计学方法
对于计量资料，数据以均数±标准差(±s)表示，数据处理采用方差分析，两两比较时采用snk-q检验;对于等级资料，数据处理采用秩和检验，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 左室心内膜电机械标测结果
细胞移植前由noga标测出的心梗面积分别为：联合组(31.8±7.3)%;细胞组(33.6±7.0)%;对照组(28.2±5.7)%，无显著差异(p>0.05)。术后4周联合组心梗面积较细胞组及对照组明显改善[联合组(20.6±6.8)%;细胞组(25.7±9.8)%;对照组(30.3±8.4)%，p均<0.05]，且细胞组较对照组心梗面积也有明显改善(p<0.05)，见图1(封二)。
2.2 选择性冠脉造影结果
细胞移植后4周各组侧支循环rentrop评分如下：联合组rentrop 1级 2只，2级 5只，3级 1只;细胞组rentrop 0级 1只，1级 4只，2级 3只;对照组rentrop 0级 2只，1级 3只，2级 1只;联合组较对照组显著增高(p<0.01)，较细胞组侧支循环也有明显改善(p<0.05)，而细胞组与对照组之间并无显著性差异。
2.3 超声心动图检测结果
细胞移植前，lvef、lvfs以及δt%各组之间没有显著性差异。细胞移植后4周，lvef、lvfs以及δt%联合组较对照组明显改善(p均<0.05)，细胞组与对照组相比各项检测指标也具有显著性差异(p均<0.05)，联合组lvef较细胞改善更为明显(p<0.05)。这些数据表明联合治疗或单纯细胞治疗可以提高心肌收缩力和心脏泵血功能，且联合组较细胞组对于lvef改善更为明显(表1)。表1 术后4周各组超声心动图检测结果比较注：与对照组相比△p<0.05;与细胞组相比▲p<0.05。
3 讨 论
20世纪90年代以来，随着心血管基础研究的进展，人们发现一些在机体生理或病理状态下具有血管生成作用的生长因子能够促进缺血组织的血管新生和侧支循环的建立，改善心肌血供，并将外源性导入这类生长因子促进血管新生的方法称为“治疗性血管生成(therapeutic angiogenesis)”。vegf是治疗血管生成较理想的选择，是已知的最具特异性的促血管生成因子，能够显著促进血管内皮细胞的增殖与迁移，促进血管新生和侧支循环建立[9]。
除治疗性血管生成外，近些年来人们针对缺血性心脏病的病理生理机制，提出了“细胞水平心肌成形术”(cellular cardiomyoplasty，ccm)，为治疗缺血性心脏病提供了一条新的有效途径。soonpaa等[10]最早开始心肌细胞的移植，他们将转基因鼠心肌细胞移植到成年小鼠正常的心肌内，发现移植细胞成活并与宿主心肌细胞形成闰盘，此后有学者研究将干细胞直接注射到心肌梗塞模型鼠的心肌，发现了重建的毛细血管和心肌，同时心功能也有改善。随着对干细胞认识的深入及“干细胞具有横向分化潜能”观点的提出，干细胞移植术用于缺血性心脏病的治疗已成为热点[11]。
有学者将两种疗法相结合对缺血性心脏病进行治疗，初步结果已证实细胞疗法和促进血管新生的基因治疗相结合对缺血性心脏病的治疗是有益的。suzuki等[12]采用重组人vegf165基因的凝血病毒载体转染大鼠骨骼肌成肌细胞，2周后发现vegf组心肌vegf的表达明显增加，新生血管明显增多，局部血管密度增加，移植的成肌细胞在宿主心肌中分化为多核肌管样细胞。与单纯成肌细胞注射核培养基注射比较，心梗面积明显缩小，心功能明显改善，提示细胞治疗与基因治疗相结合进行心梗的治疗是有效的。sugimoto等[13]将转染了vegf的h9c2成肌细胞移植至梗塞后的大鼠瘢痕区，并与直接注射vegf至梗塞区相比较，结果发现，移植的h9c2成肌细胞能在梗塞区存活，其血管新生作用与直接注射vegf相似。yau 等[14]进一步采用冷冻损伤造成大鼠心肌坏死方法，比较移植转染了和未转染vegf165的心肌细胞对心肌坏死大鼠左室功能、坏死局部供血的影响。结果发现尽管对左室功能的影响两组无明显差别，但转染组大鼠心肌坏死中心、周边的血管密度均明显高于未转染组，局部血流情况转染组也明显优于未转染组，表明给坏死心肌部位移植转染了基因的心肌细胞比移植未转染基因的心肌细胞更能促进血管的重建。进一步说明，细胞疗法与基因治疗是治疗缺血性心脏病的有效方法。
bmscs较骨骼肌成肌细胞、心肌细胞获取更加方便、实际，扩增也更加容易，更为重要的是bmscs具有多向分化能力，可能成为心肌细胞、也可能成为内皮细胞或者其它类型的细胞，这些使得bmscs在缺血性心脏病的治疗中更具有前途。本研究利用猪慢性心肌梗塞模型进一步验证了bmscs结合vegf165心肌内注射对心肌梗塞的疗效。研究显示术后4周时左室心内膜电机械标测的联合治疗或单纯细胞治疗可以使得心梗面积明显缩小，挽救缺血心肌，且联合组较细胞组效果更为明显;冠脉造影表明联合治疗改善侧支循环更加明显;超声心动图检查提示联合治疗或单纯细胞治疗可以提高心肌收缩力和心脏泵血功能，且联合治疗组较细胞组改善更为明显。这与suzuki等及sugimoto等人的研究结果相一致，进一步说明细胞疗法与基因治疗相结合可能成为治疗缺血性心脏病更为有效的方法。本研究在观察期间并未发现bmscs结合vegf165治疗组动物有血管瘤形成，但由于观察时间较短，并不能说明其远期的安全性，有待于进一步研究。
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