sle病人及其子代与sle相关基因及抗体关系研究
【关键词】 红斑狼疮,系统性;hla抗原;疾病遗传易感性;等位基因
【摘要】 目的 探讨缓解期系统性红斑狼疮(sle)病人所生子女罹患sle的危险性。方法 应用实时定量pcr技术检测14例sle病人、病人子女及18例对照者hladrb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602的频率，免疫印迹法检测入组者ena抗体谱。结果 sle病人组dqa1*0102频率显著高于对照组(rr=2.02,p<0.05)，而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602频率比较差异无显著意义(p>0.05);sle病人组 dqb1*0602频率显著高于其子女组(rr=2.06,p<0.05)，而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102频率比较差异无显著性(p>0.05);sle子女组dqa1*0102频率显著高于对照组(rr=2.14，p<0.05);而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602频率比较差异无显著性(p>0.05)。sle病人组自身抗体ssa及dsdna出现频率明显高于对照组(p=0.019、0.015)，两组间ssb及ro52差异无显著性(p>0.05); sle病人子女组所测自身抗体检出率为0。Www.11665.cOm结论 hladqa1*0102为sle的易感等位基因，dqa1*0102有一定的遗传倾向。经过系统治疗达到缓解期的sle病人生育的子女罹患sle的危险性无明显增加趋势。
【关键词】 红斑狼疮,系统性;hla抗原;疾病遗传易感性;等位基因
association of sle patients and their filial generation with slerelated genes and antibodies sun huanxia, su houheng, cui jiajia, et al (department of immunology and rheumatology, qingdao university medical college, qingdao municipal hospital, qingdao 266071, china); [abstract] objective to explore the risk of suffering from systemic lupus erythematosus (sle) in children born by patients with sle at paracmasis. methods the frequencies of hladrb1*1501, drb1*0301, dqa1*0102 and dqb1*0602 alleles of 14 sle patients and their children, and 20 healthy controls were detected by realtime pcr technology and ena antibody repertoire by immunoblotting. results in sle group, the frequency of dqa1*0102 allele was significantly higher than that in the controls (rr=2.02,p<0.05), and no significant differences of frequencies of drb1*1501, drb1*0301, and dqb1*0602 allele were noted between the two groups (p>0.05); the frequency of dqb1*0602 allele in sle patients was significantly higher than that of their children (rr=2.06,p<0.05), and no significant difference was found between them in terms of drb1*1501, drb1*0301, dqa1* 0102 allele (p>0.05). in slechildren group, dqa1*0102 allele frequency was significantly higher than that of the healthy controls (rr=2.14,p<0.05), and the differences of drb1*1501,drb1*0301, and dqb1*0602 allele were not significant between the two groups. the frequencies of autoantibodies ssa and dsdna in sle patients were higher than that of the controls (p=0.019,0.015), and no statistical differences of ssb and ro52 were recorded between the two groups(p>0.05). the detection rate of autoantibody was nil in the patients’ children. conclusion hladqa1*0102 is a susceptible allele with genetic predisposition. the risk of suffering sle in sons or daughters born by sle patients, at catabasis after systematic therapy, is not increased.
[key words] iupus erythematosus, systemic; hla antigen; genetic predisposition to disease; allele
系统性红斑狼疮(sle)是一种严重危害人类健康的难治性自身免疫性疾病。近年来，随着免疫学、实验室检测技术的发展、微卫星标记和扫描技术的应用以及医生对sle认识的不断提高，sle检出率呈上升趋势。sle虽然好发于20～45岁的育龄女性，但却不影响女性病人的生育能力。如今，大多数sle病人能够成功妊娠并生育健康的孩子[1]，但其子女罹患sle的危险性一直是人们极其关注的问题。大量的研究表明，遗传因素在sle的易感性及其表达方面起着重要作用，其中hladr2、dr3等基因与sle的相关性在很大程度上已被证实。有关sle母亲带有hlaⅱdr2、dr3基因是否增加其子女患sle的危险性，经系统治疗缓解后sle病人生育的子女sle相关基因及自身抗体的研究，国内外报道较少。本研究对2003—2009年在我院住院和门诊就诊的sle病人及其子女进行研究,以探究缓解期sle病人所生子女罹患sle的危险性。现将结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
本文14例sle病人(b组)系无血缘关系的山东汉族sle母亲，均符合1982年美国风湿病协会(acr) 修正的sle诊断标准4 条或4条以上，年龄26～37岁,平均32岁。 14例sle子女均为sle病人经系统性治疗完全缓解后所生子女(c组),年龄1～17岁,平均6岁(其中2例sle病人子女因年龄小血样未采集到，故入组sle子女共12例)。同时，选择同种族同地域健康对照者(a组)18例,年龄 23～37岁, 平均26岁;均排除自身免疫性疾病及其家族史。
1.2 实验方法
1.2.1 dna抽提 受试者采集外周静脉血2 ml于edta 抗凝管中。采用invitrigen的purelinktm genomic dna提取试剂盒,按操作步骤提取上述实验对象全血dna,置4 ℃保存，备用。
1.2.2 pcr 扩增 采用实时定量pcr技术检测所有入组者的hladrb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602等位基因。目的基因引物序列见表1，各对引物分别特异性扩增等位基因 hladrb1*1501、dqa1* 0102、dqb1*0602、drb1*0301。另外，设计一对上下游引物βaction作为内参照引物,以检测扩增体系。表1 hladrb1*1501、dqa1* 0102、dqb1*0602、drb1*0301引物序列等位基因引物序列 引物源于cell mol neurobiol[2]，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。
pcr反应体系20 μl,各反应体系均含有以下组分：带有rox的platinum sybr green qpcr super mixudg 10 μl，10 μmol/l正向引物(f)1 μl, 10 μmol/l 反向引物(r)1 μl,模板dna2 μl,高压灭菌蒸馏水6 μl。三步循环法pcr 扩增条件: 预先50 ℃ udg 孵育2 min，95 ℃预变性2 min;然后95℃变性15 s，退火温度退火45 s,72 ℃延伸30 s，共进行35个循环，最后4 ℃保存。hladrb1*0301、drb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602基因退火温度分别为56.7 ℃、62.3 ℃、58.4 ℃、62.3 ℃。研究对象部分pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测等位基因扩增情况。
1.2.3 自身抗体ena谱的检测 采用免疫印迹法检测所有研究对象自身抗体ena谱。
1.3 统计学处理
基因频率的计算采用直接计数法,用精确检验四格表资料的fasher确切概率法计算确切概率p值。对基因频率的差异有统计意义的等位基因进一步做疾病相关性分析，计算相对危险度rr。
2 结 果
2.1 sle病人drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602等位基因检测
b组病人dqa1*0102等位基因频率显著高于a组(rr=2.02,p<0.05);两组间dqb1*0602、drb1*1501、 drb1*0301等位基因频率比较，差异无显著性(p>0.05)。b组病人dqb1*0602频率显著高于c组，差异有显著性(rr=2.06,p<0.05);而drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102等位基因两组比较差异无显著意义(p>0.05)。c组dqa1*0102等位基因频率显著高于a组(rr=2.14,p<0.05);而其drb1*1501、drb1*0301、 dqb1*0602等位基因两组间比较差异无显著性(p>0.05)。见表2。
2.2 各组自身抗体ena谱检测
b组自身抗体出现频率均较a、c组高。其中，自身抗体ssa及dsdna出现频率明显高于a组(p=0.019,0.015)，而ssb及ro52频率虽高于a组，但差异无显著性(p>0.05);a组除ssa、ssb、dsdna、ro52等4种自身抗体外，另外5种抗体均未测出。c组所测自身抗体均未测出。各种抗体出现频率和百分率见表3。
3 讨 论
目前，国内外对sle的研究报道主要集中于不同人种、种族的易感基因及家族同患病例。而同时将sle病人及其经系统治疗达到完全缓解后病人生育的子女，从基因和自身抗体等方面进行研究，探表2 hladrb1、dqa1、dqb1基因与sle的关联情况表3 各组ena谱检测情况(例)抗体究缓解期sle病人所生子女罹患sle的危险性的报道尚属罕见。本实验对sle病人、病人子女从基因及抗体等方面进行研究，探究sle子女罹患sle的危险性。
本实验sle相关基因研究结果显示，sle病人dqa1*0102等位基因频率较a组显著增高，差异具有显著性，因此认为dqa1*0102等位基因可能为sle的易感基因，这与国内外dqal*0102对sle有遗传易感倾向的结论相一致[3];b组与a组dqb1*0602等位基因的出现频率比较差异无显著意义，提示无法确定dqb1*0602等位基因是否为sle的风险基因。本实验drb1*1501、drb1*0301等位基因频率b组与a组比较差异无显著意义,而对上海等地区的研究表明，dqa1*0102、dqb1*0602、drb1*1501、drb5*0101为汉族的sle易感基因型。b组dqa1*0102等位基因频率与c组比较差异无显著性，而c组dqa1*0102等位基因频率显著高于a组,这提示sle母亲增加了sle易感等位基因dqa1*0102在其子女中出现的危险性，dqa1*0102有一定的遗传易感性。c组等位基因drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602与a组比较差异无显著意义，这表明经系统性治疗达到缓解期的sle病人所生育的子女与健康者相比携带sle相关基因drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602的危险无明显增加的趋势。
sle的特征是产生大量致病性ena[4]。本实验结果显示，sle病人多种自身抗体同时出现的频率高。其中抗sm抗体和ssb抗体阳性率分别为14.3%、7.1%，较sle病人上述2种抗体阳性率分别为29.6%、15%的报道低[5]，可能与病例数较少有关。抗dsdna抗体具有较高特异性,几乎仅发现于sle病人中。文献报道sle病人抗dsdna抗体阳性率为52.7%[4]，而本实验抗dsdna抗体阳性率为71.4%，可能与入组sle病人病情处于活动期有关。抗dsdna抗体是sle病情活动的指标，抗体效价随病情缓解而下降。本文抗ssa抗体阳性率57.1%，较抗ssa抗体在sle中阳性率35%的报道高[6];很多研究证实抗ssa抗体可造成新生儿狼疮及先天性房室传导阻滞，本文sle病人子女9种自身抗体中的5种均未测出，这从一定程度上说明经系统性治疗达到缓解期的sle病人所生育的子女，虽然有携带sle易感基因的危险，但出现sle自身抗体的概率很低。
sle自身抗体与其相关基因有关联。olsen等[7]报道，白种人sle的抗dsdna抗体与hladr3、dr2、dq2、dq6相关;国内文献报道，江苏汉族sle病人抗dsdna抗体与hladrb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602相关，云南汉族sle病人抗dsdna抗体的产生与dqb1*0602相关，与drb1*1501*1502dqa1*0102dqb1*0602单倍型相关，这提示不同种族、地区sle病人自身抗体与hla的关联存在等位基因差异。本实验由于病例数较少,未做自身抗体与基因的相关分析,b组抗dsdna抗体与等位基因dqa1*0102、dqb1*0602检出率均相当高。
hladrb1*0301、dqa1*0102以及dqb1*0602均阳性的sle母亲，其所生子代出现自身抗体ssa()、ro52()、ssb(+)、dsdna()、nu(+)的频率高，这提示sle母亲存在多个sle相关基因、多种自身抗体，特别是ssa、ssb、ro52高滴度可能是sle病人子代罹患sle的高度危险因素，这与抗ro/ssa和抗la/ssb抗体与新生儿狼疮高度相关的报道结果相符[8]。buyon[9]的研究也证实，chb病人的母亲血清中均含抗ro抗体和(或)抗la抗体。
本实验从hladr、dq基因和ena抗体谱等方面进行分析，结果显示完全缓解期sle病人生育子女罹患sle的危险性无明显增加趋势，与sle病人病情控制稳定后可以安全妊娠的报道相符[10]。但有研究报道7～16岁的sle病人子女的学习无能发病率增加，其中诵读困难最普遍，与诵读困难相关的抗体分别为抗ro/ssa抗体和抗磷脂抗体[11]。因此，收集sle病人所生子女的资料,进行神经功能检测等远期随访是很必要的，但目前这方面的资料尚少见。
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