维生素c在小鼠小肠高铁吸收中的作用
【关键词】 维生素c;肠铁吸收;二价金属离子蛋白;铁转运蛋白
【摘要】 目的 探索维生素c在小肠高铁吸收中的作用。方法 用正常铁、高铁和高铁加维生素c的不同饲料喂养成年小鼠，1 w后处死取材。血清铁和总铁结合力使用试剂盒检测，十二指肠的二价金属转运蛋白1(dmt1)和铁转运蛋白(fpn)的mrna表达使用半定量rtpcr测定。结果 维生素c可减少高铁饮食引起的血清铁和转铁蛋白结合力升高(p<0.05)，同时维生素c抑制了高铁诱导的十二指肠dmt1和fpn表达增加(p<0.05)。结论 维生素c在机体高铁状态下具有抑制肠铁吸收的作用。
【关键词】 维生素c;肠铁吸收;二价金属离子蛋白;铁转运蛋白
【abstract】 objective to detect the role of vitamin c on intestine high iron absorption. methods the adult mice were fed by normal iron, high iron and high iron + vitamin c, and sacrificed after 1 week. the serum iron and total iron binding capacity (tibc) were determined with reagent kit. the mrna expressions of divalent metal transporter 1 (dmt1) and ferroportin (fpn) of intestine were measured with quasiquantitative rtpcr. results vitamin c could reduce the raise of serum serum iron and tibc caused by high iron diet (p<0.05). vitamin c also inhibited the mrna expression of dmt1 and fpn induced by high iron diet (p<0.05).conclusions vitamin c can inhibit intestine iron absorption on condition of iron replete.
【key words】 vitamin c; intestine iron absorption; divalent metal transporter 1; ferroportin
铁是生物发育所必需的元素之一，参与物质代谢、红细胞生成和细胞分裂等多重生物学功能〔1〕，它的缺乏是贫血发生的重要原因。wWw.11665.CoM然而，铁还参与了导致机体损伤的活性氧物质生成，随着年龄增长组织出现的铁沉积可造成机体衰老和多种退行性疾病的发生〔2〕，因此维持机体内稳态尤其是高铁状态下抑制铁吸收具有十分重要的意义〔3〕。维生素c可促进铁的吸收，是补铁常用辅助品之一，然而维生素c作为老年人提倡补充的化合物是否可减少铁沉积尚缺乏实验证据。食物中的三价铁主要是在十二指肠被吸收，首先把三价铁还原为二价铁，然后再与二价金属转运蛋白1(divalent metal transporter 1,dmt1)结合并转运至吸收细胞内，进入吸收细胞内的铁除了满足吸收细胞本身需要外，其余的铁由铁转运蛋白(ferroportin,fpn)释放出吸收细胞并进入血循环，经血循环供机体各器官组织应用〔4〕。本实验研究以成年小鼠为材料，探索维生素c对十二指肠携带铁应答元件(ironresponsive element,ire)的dmt1(dmt1+ire)和fpn的mrna表达影响。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
实验用3月龄昆明小鼠(清洁级)购自河北省实验动物中心，体重35 g左右; trizol试剂盒、苜蓿花叶病毒(amv)逆转录酶、taq酶、维生素c和焦碳酸二乙酯(depc)等均购自上海生工，其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 动物分组和处理
15只小鼠分为3组，分别用正常铁饲料(含0.5 g/kg乳酸亚铁)、高铁饲料(含2g/kg乳酸亚铁)和高铁饲料加维生素c(含2 g/kg乳酸亚铁和0.8 g/kg的维生素c)喂养1 w(正常饮水)，饲料其他成分均相同。
1.2.2 取材
取材前12 h禁食以减少小鼠肝糖原积累。腹腔注射0.4%戊巴比妥钠麻醉小鼠后剖开腹腔，心脏取血以制备血清测定血清铁和总铁结合力，使用depc处理的生理盐水心脏灌流，完毕后取适量十二指肠放入trizol中供rna提取。
1.2.3 小鼠血清铁和总铁结合力测定
使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒按照说明书完成，然后计算转铁蛋白饱和度(血清铁/总铁结合力)。
1.2.4 小鼠十二指肠dmt1+ire和fpn的mrna半定量rtpcr检测
十二指肠黏膜首先进行总rna提取和浓度测定，取相同量总rna应用逆转录获得cdna后对dmt1+ire、fpn和肌动蛋白(βactin)进行pcr 扩增34 个循环(94℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min)，将pcr产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，所得结果用凝胶成像系统扫描并计算吸光度值。实验中所用基因的pcr引物均为上海生工生物工程技术有限公司合成，其序列分别为：dmt1+ire：正义链为tcctggactgtggacgct;反义链为ggtgttcagaagatagagttcagg;fpn：正义链为acaaacaaggggagaacgc;反义链为atgacggacacattctgaacca;βactin：正义链为agccatgtacgtagccatcc;反义链为tttgaggtcacgcacgattt。
1.3 统计学分析
数据以x±s表示，应用spss11.5统计软件进行单因素方差分析。
2 结 果
2.1 维生素c对高铁饮食增加小鼠dmt1+ire和fpn mrna表达的抑制作用
半定量rtpcr检测表明，高铁饮食相对于正常铁喂养明显增加了小鼠dmt1+ire和fpn的mrna表达(p<0.05)，在添加维生素c后，这种增加效应明显受到抑制(p<0.05)。见图1。图1 维生素对高铁状况下肠铁吸收蛋白基因表达的影响
2.2 维生素c对高铁饮食血清铁和转铁蛋白饱和度的影响
相对于正常铁饮食，高铁饲养可显著升高小鼠血清铁和转铁蛋白饱和度(p<0.05)，而添加维生素c后可显著减少高铁饮食引起的血清铁和转铁蛋白饱和度升高(p<0.05)。见表1。表1 维生素c对高铁饮食小鼠血清铁和总铁结合力的影响
3 讨 论
已知，缺铁情况下维生素c可促进铁吸收，因此常用作补铁辅助药物〔5〕，然而研究还发现维生素c拥有减少高铁诱发的氧化损伤作用〔6〕，这种作用可能有两种机制，一种是作为抗氧化试剂的维生素c通过还原作用来实现〔7〕，另一种是维生素c本身调节铁代谢相关基因的表达以减少铁吸收〔8〕。本研究表明，高铁饲料可促进小鼠十二指肠dmt1+ire和转铁蛋白的表达，从而增加了铁的摄入，因此机体血清铁和fpn饱和度增加，机体损伤增多，如高铁饮食小鼠常表现出发育迟缓，反应力下降甚至死亡等。在高铁饲料中补充维生素c后，高铁引起的dmt1+ire和fpn的mrna表达升高效应明显受到抑制，从而铁吸收减少，血清铁降低，这说明高铁状态下维生素c可通过抑制肠铁吸收而保护机体免受损伤。
最近发现低氧诱导因子2α(hypoxia inducible factors2α,hif2α)在肠铁吸收过程中发挥了重要作用〔9〕。低铁状态下，hif2α可促进dmt1+ire和fpn的基因表达以增加铁的吸收，而铁过载引起hif2α泛素化修饰并被蛋白酶体降解，dmt1和fpn表达减少而抑制铁吸收〔10〕。hif2α泛素化修饰前需要首先羟基化，该过程有多种辅助因子的参与，如低氧、高铁、α酮戊二酸及维生素c等〔11〕，因此高铁状态下维生素c的存在有利于hif2α最终降解和dmt1的表达抑制，减少铁吸收从而更好的维持机体铁稳态。
本实验初步阐明了维生素c在高铁状态下对肠铁吸收的抑制作用，一方面有利于对铁稳态调节机制的理解，另一方面在将来对缓解老年人铁过载引起的机体损伤方面也有重要裨益。
【参考文献】
1 andrews nc.forging a field:the golden age of iron biology〔j〕.blood，2008;112(2):21930.
2 xu j，knutson md，carter cs,et al.iron accumulation with age，oxidative stress and functional decline〔j〕.plos one,2008;3(8):2865.
3 hentze mw,muckenthaler mu,andrews nc.balancing acts:molecular control of mammalian iron metabolism〔j〕.cell,2004;117(3):28597.
4 anderson gj,frazer dm,mclaren gd.iron absorption and metabolism〔j〕.curr opin gastroenterol,2009;25(2):12935.
5 péneau s，dauchet l，vergnaud ac,et al.relationship between iron status and dietary fruit and vegetables based on their vitamin c and fiber content〔j〕.am j clin nutr,2008;87(5):1298305.
6 duarte tl，jones gd.vitamin c modulation of h2o2induced damage and iron homeostasis in human cells〔j〕.free radic biol med,2007;43(8):116575.
7 rehman a，collis cs，yang m,et al.the effects of iron and vitamin c cosupplementation on oxidative damage to dna in healthy volunteers〔j〕. biochem biophys res commun,1998;246(1):2938.
8 kang js，cho d，kim yi,et al.sodium ascorbate (vitamin c) induces apoptosis in melanoma cells via the downregulation of transferrin receptor dependent iron uptake〔j〕.j cell physiol,2005;204(1):1927.
9 郭晓强,高姗姗,李 会,等.缺氧诱导因子2α与肠铁吸收〔j〕.生命的化学,2009;29(6):8937.
10 mastrogiannaki m，matak p，keith b,et al.hif2 alpha，but not hif1alpha，promotes iron absorption in mice〔j〕.j clin invest,2009;119(5):115966.
11 kaelin wg jr.the von hippellindau tumour suppressor protein:o2 sensing and cancer〔j〕.nat rev cancer,2008;8(11):86573.
