【摘要】 目的 探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(ape1)基因在原发性肝细胞癌(hcc)的表达及其与临床病理变化的关系。 方法 应用免疫组织化学方法,检测包含hcc及转移灶、癌旁肝硬化组织、癌旁慢性肝炎组织和正常肝组织的组织芯片中ape1的表达情况,结合临床病理资料进行统计分析。 结果 ape1在癌旁肝硬化组织、癌旁慢性肝炎组织和正常肝组织以细胞核表达为主,在hcc和转移灶组织以细胞质细胞核联合表达为主(p<0.01)。细胞质与细胞核染色强度均与hcc分级和转移密切相关(p<0.01),细胞质染色强度还与肿瘤包膜有无浸润有关(p<0.01)。 结论 ape1蛋白表达与hcc恶性表型有关,ape1蛋白过表达及细胞质表达的出现可能成为hcc预后不良的指标之一。
【关键词】 癌,肝细胞; 内切核酸酶类; 芯片分析技术; 免疫组织化学; 预后
expression of ape1 and its clinical implication
in hepatocelluar carcinoma using tissue chip assay
zheng zhihua, huang aimin, liu jingfeng, zang shengbin, gao lingyun, chen shuiping
1.division of pathology, school of basic medical science, institute of oncology,
fujian medical university, fuzhou 350004, china
2.department of surgery, the affiliated first hospital, fujian medical university, fuzhou 350005, china
abstract: objective to study the association of apurinc/apyrimidinic endonuclease1(ape1) expression with clinicopathologic parameters in hepatocelluar carcinoma(hcc). methods ape1 protein was detected in seven tissue chips, which contains hcc, para-carcinoma tissues, para-carcinoma choronic hepatitis tissues and normal liver tissues by immunohistochemistry. detailed analysis of ape1 expression with clinicopathologic parameters was performed. results ape1 was mainly detected in nuclei of para-carcinoma tissues, para-carcinoma chronic hepatitis tissues and normal liver tissues. while ape1 expressed in both nucleus and cytoplasm only found in hcc and metastatic tumor(p<0.01). a statistic significantty correlation between the positive degree of ape1 expression in both nucleus and cytoplasm with histological grade of hcc and metastasis(p<0.01). furthermore, the positive degree in cytoplasm was correlated with capsule invasion(p<0.01). conclusion the expression of ape1 is associated with the malignant phenotype of hcc. overexpression and cytoplasm localization of ape1 can be used as a poorly prognostic marker for hcc.
key words: carcinoma,hepatocelluar; endonucleases; microchip analytical procedures; immunohistochemistry; prognosis
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是我国最常见的恶性肿瘤之一,其癌变是一个多步骤的渐进过程,与慢性肝脏损伤、肝炎和肝硬化有关。WWw.11665.cOM脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(ape1)是一种多功能的碱基切除修复途径的关键酶,具有脱嘌呤/脱嘧啶位点(ap位点)核酸内切酶(ape)活性,修复烷化剂、氧自由基、电离辐射等因素产生的dna损伤。ap位点是dna最常见的损伤位点之一,具有细胞毒性和基因毒性,若不能修复,可阻碍dna的复制,导致基因突变、染色体微卫星不稳定性或细胞凋亡,最终可导致肿瘤的发生。ape1又名氧化还原因子1(ref-1),可调节许多转录因子的dna结合活性,参与细胞增殖、分化和细胞凋亡等多种关键的细胞反应。笔者采用组织芯片技术检测ape1在hcc、转移灶中的表达情况,分析ape1表达与hcc临床病理因素的关系。
1 对象与方法
1.1 对象
收集福建医科大学附属第一医院1998—2006年手术切除标本,其中hcc 126例,癌旁肝硬化组织(距癌组织<2 cm,镜下无癌)95例,癌旁慢性肝炎组织(距癌组织>5 cm)46例,肝内外转移灶29例,术前均未化疗及放疗。男性114例,女性10例,≥60岁28例,＜60岁96例。根据《中国常见肿瘤诊治规范》对肿瘤进行组织学分类:梁状型、假腺管型、实体型、硬化型。根据edmondson组织学分级法进行病理学分级分为i~ⅳ级,并判断有无包膜癌浸润和发生肝内外转移。根据肿瘤大小和数量分为3组:肿瘤直径<3 cm,肿瘤直径3~5 cm,肿瘤数量>2个或直径>5 cm。另收集正常肝组织5例,来源于1998-2006年福建医科大学附属第一医院手术切除的肝血管瘤的瘤旁肝组织。
1.2 方法
鼠抗人ape1 mab(克隆号13b8e5c2,美国novus biologicals公司),工作浓度1∶18 000;elivision plus免疫组织化学试剂盒(kit-9901,福州迈新生物科技有限公司)。按照免疫组织化学elivision plus二步法试剂盒说明操作,dab显色。以pbs代替一抗作为阴性对照。
1.3 制作组织芯片
根据研究目的设计点阵,选择典型区域在玻片和相应蜡块做标记。将本研究小组已制成的定位板盖在受体蜡块上［1］,按照定位板的点阵打孔,并从供体蜡块已标记的典型区域钻取组织,每个区域3个组织孔,转移到受体蜡块的承载孔。将组织芯片和周围蜡质加热融合。
1.4 结果判断
参照bamberger等的半定量积分法［2］,在光镜下分别对阳性染色细胞数和染色强度进行判定。取表达最强的部分,按着色程度计分,无着色者为0分;浅黄色、略高于背景者为1分;棕黄色、明显高于背景者为2分;强染、棕褐色者为3分。同时按阳性细胞数计分,≤5％为0分,6％~25％为1分,26％~50％为2分,51％~75％为3分,>75%为4分。两项相加后分4级:0~1分为阴性(－),2分为阳性(＋),3~4分为中等阳性(),5分以上为强阳性()。取各点的平均值综合判断。
1.5 统计学处理
采用spss 11.5统计软件分析,选用参数秩和检验对两个样本半定量等级资料进行分析,选用kurskal-wallis h 检验对多个样本半定量资料进行分析,选用spearman秩相关进行指标间的相关分析。
2 结 果
组织芯片免疫组织化学封片后观察,部分组织有脱片,以每个病灶的3个点(至少有2个点)满足研究需求为标准,否则剔除该病例。126例hcc中2例由于组织脱落不能进行分析,其余124例均进入有效分析。
2.1 ape1定位表达
ape1蛋白在各组织的定位表达见表1。不同实验组ape1表达方式不同,在正常肝组织、癌旁肝炎组织和癌旁肝硬化组织,ape1主要以细胞核表达为主;在hcc和转移灶,ape1主要以细胞质和细胞核联合表达为主,显微镜下观察到细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒(图1a)。124例hcc中,44例为单纯细胞核染色,镜下仅在细胞质中出现棕黄色颗粒(图1b)。表1 各组ape1蛋白的定位表达（略）
2.2 ape1的半定量表达
各组细胞核和细胞质着色强度见表2。表2 各实验组ape1蛋白的半定量表达（略）
2.3 ape1表达与hcc临床病理因素的关系
随着病理组织学分级的升高,ape1细胞核阳性强度依次增高(rs=0.353,p=0.001),细胞质阳性强度亦有依次增高(rs=0.217,p=0.015)。包膜浸润组与包膜无浸润组相比,细胞质阳性强度具有显著差异(p<0.001),而细胞核阳性强度无差异。与无肿瘤转移组相比,肿瘤转移组中细胞核阳性强度明显升高(p=0.002)。细胞质阴性染色13例,占转移阳性组的44.8％,其他3种染色强度结果均低于阴性染色组。ape1表达与年龄、性别、肿瘤大小、组织学分型无关(表3)。表3 ape1蛋白表达与hcc临床病理特征的关系（略）
3 讨 论
本研究采用组织芯片和免疫组织化学相结合,检测ape1在hcc的表达,节约实验成本,大大提高实验效率,并保证实验条件的同一性,减少了因普通实验方法中分批、分次实验造成的实验误差,提高了实验结果的可*性。同时,通过对手工制作组织芯片的方法进行改良,应用改良的打孔针和取材针,提高芯片制作的效率和质量,使检测ape1表达的实验系统更符合观察和进一步研究需要。
ape1是一个具有双功能的限速酶,既负责修复各种因素产生的ap位点,又通过保持许多转录因子(如p53、nf-κb、pax-5、pax-8、hif-1、creb、atf和hlf等)dna结合区域特异性半胱氨酸的还原状态,维持转录因子的激活还原态,从而调节dna结合活性,发挥重要作用。以上两种功能的异常均可导致肿瘤的发生。
在人体细胞中,ape1的表达可以细胞质型、细胞核型、细胞质/细胞核型3种模式存在。既往研究在卵巢癌、皮肤恶性黑色素瘤和结肠癌等多种肿瘤中发现,正常组织中ape1以细胞核表达为主,肿瘤组织以质核联合表达为主,ape1表达定位的改变与肿瘤的恶性转化密切相关［3-5］。本研究结果显示,质核联合表达方式比例在癌旁肝炎组织和癌旁肝硬化组织、hcc和转移灶组依次递增,正常肝组织未见质核联合表达方式,差别具有统计学意义,提示hcc ape1蛋白表达定位的改变,即从细胞核表达方式转变成细胞质表达方式,具有重要意义。细胞质表达方式的出现,可能与肿瘤的侵袭、转移有关。该结果与以往对肺癌、乳腺癌的相关研究结果一致［6-7］。
目前,对ape1的定位表达机制尚缺乏明确的论述。tell等研究发现,各种导致ape1表达增强的应激因素(如uv、hbv、hcv和ros等),可参与调控ape1在细胞内运输［8］。ape1在恶性肿瘤中的细胞质定位,可能是外来因子造成了线粒体内的dna 损伤,在线粒体内出现了dna ap 位点的修复。因此,推测ape1在恶性肿瘤中的定位机制与其所受的应激有关。本研究发现ape1在hcc中主要定位于细胞质,而hbx是引起ape1移位至细胞质的主要损伤因子,推测hcc 中ape1在细胞质表达与hbx损伤有密切关系。
vittorio等发现,低分化肝细胞癌与高分化肝细胞癌相比,ape1细胞质染色强度明显增强［9］。在脑星形细胞肿瘤中发现,ⅲ、ⅳ级肿瘤的ape1核表达阳性强度显著高于ⅰ、ⅱ级,并与肿瘤复发有关［10］,进一步提示ape1的表达增强与肿瘤的恶性分化具有明显关系。本研究结果显示,细胞核表达阳性强度和细胞质表达阳性强度在各实验组中不同。在正常组、癌旁肝炎组、癌旁肝硬化组、hcc组和转移组同样分别呈依次递增趋势(p＝0.001)。因此认为ape1过表达与hcc发生、发展密切相关。进一步分析ape1表达水平与临床各病理参数之间的关系,结果显示ape1细胞核和细胞质阳性强度与肿瘤病理学分级、有无肝内外转移灶密切相关,后者还与包膜有无肿瘤浸润有关。ape1在细胞质和胞核过表达均与hcc的恶性临床表型有密切关系。
puglisi 等研究结果显示,ape1蛋白的细胞质定位与肺癌、乳腺癌的不良预后有关［6-7］。由于本研究尚缺乏完整的随访资料,未能对ape1蛋白的表达与预后的关系进行直接论述,但本研究显示,ape1的细胞质表达与肿瘤的转移有关,且ape1过表达还与包膜侵犯和病理学分级有关系,而这些参数与hcc的侵袭力和预后均有非常密切的关系。因此推测,ape1蛋白的细胞质表达及细胞质+细胞核过表达可能与hcc的预后有关。
对hcc中ape1表达特点的研究具有重要意义,其细胞质表达方式的出现和阳性强度的变化,可作为判断hcc患者预后和肿瘤恶性表型的指标之一。
【参考文献】
［1］臧盛兵,黄爱民,高凌云,等. 手工制作组织芯片方法的改良及其在肝细胞癌研究中的应用［j］. 中国组织化学与细胞化学杂志，2007，16（3）:385-388.
［2］bamberger a m,riethdorf l,milde-langosch k,et al. strongly reduced expression of the cell cycle inhibitor p27 in endometrial neoplasia［j］. virchows arch, 1999,434(5):423-428.
［3］tanner b,grimme s,schiffer i,et al. nuclear expression of apurinic/apyrimidinic endonuclease increases with progression of ovarian carcinomas［j］. gynecol oncol, 2004,92(2):568-577.
［4］yang s,irani k,heffron s e,et al. alterations in the expression of the apurinic/apyrimidinic endonuclease-1/redox factor-1(ape/ref-1) in human melanoma and identification of the therapeutic potential of resveratrol as an ape/ref-1 inhibitor［j］. mol cancer ther, 2005,4(12):1923-1935.
［5］牟江洪,肖华亮,向德兵,等. 大肠癌ref-1/ape的表达特点及其意义［j］. 第三军医大学学报, 2006,28(2):111-113.
［6］puglisi f,aprile g,minisini a m,et al. prognostic significance of ape1/ref-1 subcellular localization in non-small cell lung carcinomas［j］. anticancer res, 2001,21(6a):4041-4049.
［7］puglisi f,barbone f,tell g,et al. prognostic role of ape/ref-1 subcellular expression in stage ⅰ-ⅲ breast carcinomas［j］. oncol rep, 2002,9(1):11-17.
［8］tell g,damante g,caldwell d,et al. the intracellular localization of ape1/ref-1: more than a passive phenomenon［j］. antioxid redox signal, 2005,7(3-4):367-384.
［9］di maso v,avellini c,crocè l s,et al. subcellular localization of ape1/ref-1 in human hepatocellular carcinoma: possible prognostic significance［j］. mol med, 2007,13(1-2):89-96.
［10］肖华亮,李增鹏,牟江洪,等. 多功能基因ape/ref-1 在人脑星形细胞肿瘤中的表达及与预后的关系［j］. 中华肿瘤防治杂志, 2006,5(13):724-728.
