摘要】 目的: 采用酵母细胞分泌型载体ppic9k表达人可溶性补体受体（scr1）, 研究重组人scr1融合蛋白的体外生物学活性。方法: 从人外周血中提取总rna, 应用rtpcr获得人scr1全长cdna, 然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体ppic9k中, 构建含人scr1的重组质粒（ppic9kscr1）, 经测序鉴定正确, 电转化入毕赤酵母细胞smd1168中, 将经g418抗性筛选出的重组scr1酵母细胞株进行pcr鉴定, 经甲醇诱导, 表达产物经sdspage分析和western blot鉴定, 通过ni2+nta agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果: 获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体ppic9kscr1, 经g418筛选及pcr鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株, 经甲醇诱导含ppic9kscr1的酵母smd1168细胞表达出重组scr1融合蛋白。此蛋白在sdspage上表现为mr约31000的蛋白区带, 在western blot分析中可被scr1的cd35单克隆抗体（mab）识别。经ni2+nta agarose亲和层析纯化后得到较纯的scr1融合蛋白及较高的生物学活性。结论: 人scr1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达, 并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。
【关键词】 可溶性补体受体1 毕赤酵母细胞 生物学活性 真核表达载体
补体受体1（complement receptor type l, cr1）又称c3b/c4b受体, 在人白细胞表面被命名为cd35分子, 是最早定型的补体受体, 也是目前所知最重要的一种补体受体。wWW.11665.coMweisman等[1]于1990年首次研制出缺乏跨膜区和胞内区的可溶性补体受体1（soluble complement receptor type l, scr1）是cr1细胞外片段。并证明了保留天然cr1已知的所有功能单位, 但丧失信号转导作用, 用于阻断人类疾病对补体不适当激活造成的机体组织损伤, 对治疗和诊断补体介导的自身免疫性疾病、 病毒感染、 肝病、 器官移植排斥反应等疾病中具有广阔的应用前景和较高的经济效益。因此, 运用基因工程方法构建真核表达scr1, 具有一定的研究和应用价值。毕赤酵母菌（pichia pastoris）是一类常用的基因工程及工业表达体系, 具有高生物菌体产量、 强启动子、 高分泌效率、 有一定的蛋白质翻译后加工, 有利于真核蛋白的表达等优点, 便于进行高密度培养和放大发酵规模。目前人们已利用毕赤酵母系统成功表达了许多外源蛋白[2, 3]。为了下一步研究scr1用于补体介导的自身免疫性疾病、 病毒感染、 肝病、 器官移植排斥反应等疾病诊断和治疗的可能性, 我们从人全血中克隆获得的全长cdna, 并在毕赤酵母中进行了表达和生物学活性鉴定。
1 材料和方法
1.1 材料
巴斯德毕赤酵母细胞smd1168(pep4△his4)、 酵母分泌型表达载体ppic9k由福州总医院全军检验中心杨湘越主任技师惠赠; 表达于大肠杆菌bl21（de3）中的重组pet28ascr1质粒, dh5α为本室保存; rna全血抽提试剂盒购于qiagen公司; 逆转录酶购于promega公司; 胶回收试剂盒购自博日科技有限公司; 3s柱离心式酵母基因组制备试剂盒购于申能博彩生物科技有限公司; pyrobest高保真dna聚合酶、 各种限制性内切酶、 t4连接酶、 dna marker dl 2000、 1000 bp dna ladder marker、 蛋白marker、 蛋白预染marker均购自takara公司; 引物合成及核苷酸序列均由上海英俊生物技术有限公司和上海生工生物工程技术有限公司测定; 溴化乙锭（eb）、 生物素、 酵母氮碱（ynb）干粉、 d山犁醇等均购自上海生工生物技术有限公司; ni2+nta agarose购自qiagen公司; bca法测定蛋白试剂盒购自pierce公司; g418（氨基糖苷类抗菌素）购于太阳马生物工程有限公司; 鼠抗人cd35 mab、 辣根过氧化物酶（hrp）标记的山羊抗小鼠igg均购于晶美公司; 绵羊红细胞溶血素购于浙江省玉环县南方试剂厂; 其他所用试剂均为国产或进口分析纯; ypd、 bmgy、 bmmy和md培养基均按invitrogen公司的毕赤酵母菌实验操作手册配制; pe2400型dna扩增仪为abi公司产品; 电转杯、 电击仪、 trans blot电转印仪及fluorstm multilmager凝胶成像系统均为biorad公司产品。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒ppic9k scr1的构建
（1）扩增 scr1基因的引物: 5′tct ctc gag aaa aga gag gct gaa gct gcc cca gat cat ttt ctg3′; 下游引物: 5′tct gcggccgccta gtg atg gtg atg gtg atg ctc cca ttt gtt cag ggc3′。以重组pet28ascr1质粒为模板,
用pyrobest高保真dna聚合酶扩增所需克隆的目的片段scr1。（2）pcr扩增条件: 94℃变性5 min; 94℃ 1 min; 57℃ 1 min; 72℃ 1 min, 35个循环, 最后72℃延伸10 min。pcr产物经加eb的琼脂糖电泳后回收目的条带。（3）重组质粒ppic9kscr1构建: 用not i、 snab i双酶切pcr回收产物和ppic9k载体, 回收酶切过的ppic9k载体和目的片段。scr1基因与ppic9k连接反应体系如下: pcr产物14 μl、 ppic9k 2 μl、 t4连接酶2 μl、 10×t4连接酶缓冲液2 μl。将scr1基因与ppic9k于16℃连接过夜, 以连接产物转化感受态dh5α菌。将转化菌涂布于含400 mg/l氨苄青霉素的lb培养板上, 放37℃培养过夜。随机挑选5个转化子接种于含400 mg/l氨苄青霉素lb培养液中, 培养12～14 h, 少量抽提质粒dna进行pcr鉴定和酶切鉴定, 从鉴定后的阳性克隆中随意选1个克隆命名为ppic9kscr1, 分别送上海英俊和上海生工有限公司进行正、 反向测序
分析。测序结果通过国际互联网络进行同源比对分析, 以美国国立生物信息中心（ncbi）的blast作为主要的检索工具比对及人工比对, 获得了预期的扩增目的片段, 测序结果与genbank登录的scr1基因片段完全一致。
1.2.2 感受态毕赤酵母smd1168菌的制备
挑选smd1168酵母菌单个菌落接种于10 ml ypd培养液中, 于30℃ 230 r/ min振荡培养24 h。取出转接种于50 ml的三角烧瓶中, 于30℃ 230 r/ min振荡培养过夜。扩增菌体量至菌液a600为2～6时, 在4℃以4000 r/ min离心5 min。收获菌体沉淀, 用100 ml冰预冷的无菌去离子水重悬后同上离心条件洗涤3次, 最后1次用1 mol/l预冷的山梨醇洗涤1次, 根据菌体的沉淀量加200 μl预冷的1 mol/l山梨醇混匀。
1.2.3 重组ppic9kscr1电转化酵母smd1168菌
从测序确认的阳性克隆dh5α菌中抽提质粒dna, 用sal i酶线性化。取感受态酵母smd1168菌200 μl, 加入到100 μl线性化的质粒（经沉淀后溶于约15 μl去离子水）中混匀, 转移至冰预冷的0.2 cm电转杯中, 置冰浴中静置5 min。在biorad genepulser电转仪（参数1300 v, 25 μf, 200ω）中进行电击后, 立即将1 ml冰预冷的1 mol/l山梨醇加入到电转杯中。将电转杯中液体转移至1.5 ml的离心管中, 每200 μl转化物均匀涂布于缺乏组氨酸的md平板上, 倒置于30℃培养生长72 h直至克隆形成。
1.2.4 重组酵母smd1168阳性转化子的高拷贝外源基因整合筛选及鉴定
将阳性转化子在md培养板形成的克隆菌, 点种在g418浓度在3 g/l的ypd培养板上, 30℃培养4 d, 筛选高拷贝外源基因整合菌株。挑选单个阳性菌落,按试剂盒说明提取酵母smd1168菌转化的基因组dna作为模板, 用ppic9kscr1构建引物及条件进行pcr扩增筛选鉴定, pcr产物经加eb的琼脂糖凝胶电泳分析。得到的阳性克隆菌株, 接种在不含g418的yepd培养基进行扩增并加甘油后放-70℃冰冻保存菌株。
1.2.5 外源基因在酵母smd1168菌中的诱导表达
随机取2株巴斯德酵母smd1168克隆菌落接种于甘油复合酵母（bmgy）培养液中30℃ 250 r/min振荡培养24 h后扩增菌体量至菌液a600为2～6, 离心后弃去上清, 收集菌体, 沉淀菌重悬于bmmy诱导培养液中, 使其a600=1, 30℃振荡培养96 h后, 每24 h补加5 ml/l的甲醇并在不同时间(24、 36、 48、 60、 72、 84、 96 h)各取1 ml离心收集上清置-20℃保存。无外源基因的空载体ppic9k转入宿主菌smd1168作为阴性对照。培养上清做sdspage分析, 并对表达产物做western blot分析及表达蛋白纯化[4]。
1.2.6 重组人scr1表达蛋白生物学活性检测 利用绵羊红细胞与相应抗体（溶血素）结合形成的复合物, 可激活血清中的补体, 导致红细胞溶解, 当红细胞和溶血素量一定时, 在一定时间内, 溶血程度与补体量及活性呈正相关。在接近50%溶血（ch50）时, 二者之间近似直线关系, 故以50%溶血作为最敏感的判定终点。以引起50%溶血所需的最小补体量为一个ch50u, 可计算出待测血清中总的补体溶血活性, 以ch50u/ml表示。
本试验主要反应补体经典活化途径的溶血功能, 其结果与补体c1c9各组份的量及活性有关。scr1既能与c3b结合又能与c4b结合, 可阻断c5转化酶的形成, 从而阻断后续的c5a及攻膜复合体的形成。常规法采取豚鼠血4℃分离血清, -20℃分离保存。按ch50法[5]及试剂说明书操作。
实验分为补体溶血组和scr1融合蛋白抑制补体溶血组, 后者加入0.1 ml scr1融合蛋白, 观察抑制补体活性外, 其余步骤同补体溶血组。血清补体活性减去scr1融合蛋白抑制后的补体活性, 即为重组scr1融合蛋白抑制的补体活性。
2 结果
2.1 重组质粒的构建及鉴定
将pcr产物和ppic9k载体, 以not i、 snab i双酶切回收产物连接, 连接好的重组ppic9k scr1质粒转化dh5α后, 小量抽提质粒并用pcr鉴定（图1）和酶切鉴定（图2）证实, 目的片段已插入, 测序结果显示, 序列完全正确。
2.2 高拷贝外源基因整合筛选及pcr鉴定
将阳性转化子在md培养平板形成的克隆菌, 点种在g418培养平板上, 30℃培养3～4 d后（图3）, 筛选高拷贝外源基因整合菌株并提取基因组dna用pcr鉴定（图4）。
2.3 重组ppic9kscr1的表达
携有重组ppic9kscr1的酵母smd1168宿主菌和空白ppic9k的酵母宿主菌分别经甲醇诱导表达后, 培养上清与2×上样缓冲液等量混合, 煮沸10 min, 上样进行sdspage电泳, 考马斯亮蓝r250染色, 在mr>31000处有一蛋白条带（图5）及western blot(图6)。
2.4 生物学活性检测结果
血清补体ch50u为266.7 u/ml, 加入scr1融合蛋白抑制后, 血清补体ch50为89 u/ml。抑制补体活性为177.7 u/ml。
结果显示scr1融合蛋白具有明显抑制补体活性的作用。
3 讨论
cr1又称c3b/c4b受体、 cd35分子, 是一种细胞表面糖蛋白, 分布于多种细胞表面, 如红细胞、 单核细胞、 b淋巴细胞等均有cr1附着。cr1在不同的细胞上生物活性不尽相同。体内90%的cr1存在于红细胞上,少量游离于血浆中。红细胞表面的cr1约占血循环的85%以上具有广泛的生理作用。cr1是唯一既能对经典途径及替代途径c3/c5转化酶拥有衰变加速活性, 又有辅助ⅰ因子裂解c3b/c4b作用的补体调节蛋白。主要功能有: 抑制补体活性的作用; 作为调理素受体, 增强吞噬细胞对c3b/c4b包被颗粒及微生物的吞噬作用以及对较小ic吞噬; 通过红细胞的cr1运送ic至肝脏等处, 经ⅰ因子裂解c3b使ic与红细胞解离, 再被单核细胞所清除; 为b细胞激活的调节剂。重组scr1是利用基因工程技术, 在工程细胞表达受体的膜外区, 保留与配体特异性结合的能力, 但丧失信号转导功能, 并能与膜表面受体竞争结合配体, 从而发挥受体阻断剂的作用。重组scr1的主要优点是其属于人体自身成分, 在治疗中不易引起免疫应答, 因而安全性较好。
由于cr1是真核细胞蛋白, 对于真核基因产物主要是糖基化修饰与蛋白生物活性之间的关系。为此我们采用分泌型表达载体ppic9k, 成功构建了scr1在毕赤酵母smd1168中的ppic9kscr1酵母表达载体和原核表达系统, 克服了大肠杆菌等原核表达体系无翻译后修饰、 需复性的不足, 为临床诊断及治疗提供了一种较为接近人体天然蛋白的表达方式。酵母ppic9k载体属于穿梭质粒, 既可在酵母中表达, 也可在原核表达。酵母smd1168是近来开发的一类蛋白酶缺失的宿主菌, 为表达外源蛋白提供了一个减少降解的环境,有广泛的应用价值[6]。酵母菌属于真核表达系统, 具有一定的蛋白翻译后加工, 有利于真核蛋白表达, 因此近年来越来越多的人们选择用酵母细胞表达人蛋白。整合表达载体转化宿主酵母菌时, 可以和宿主酵母菌染色体上的相应位点发生互换, 从而整合到酵母菌
