【摘要】 目的：比较研究衰老进程中各年龄段大鼠淋巴细胞凋亡率的差异及淫羊藿总黄酮（ef）对老年期细胞凋亡的干预作用。方法：选用sd大鼠脾脏分离的淋巴细胞为研究对象，用流式细胞方法，比较从出生后3天直到27月龄衰老进程中，各代表性年龄段的细胞凋亡率差异，并观察ef对老年过度细胞凋亡的影响作用。结果：刚出生3天组的凋亡率最低，随着增龄，细胞凋亡率逐渐升高，仅10月龄组例外，其凋亡率小于4月龄组，27月龄的细胞凋亡率最高。ef干预后，27月龄组的细胞凋亡率明显下降，介于10月龄与18月龄之间水平，以上差异均有显著统计学意义(p<0.05～p<0.001)。结论：在衰老进程中，大鼠淋巴细胞的凋亡率随增龄而逐渐升高，在老年大鼠存在过度凋亡现象，而ef可抑制老年淋巴细胞过度凋亡。
【关键词】 淫羊藿总黄酮 流式细胞 细胞凋亡 免疫衰老
comparative studies of the apoptosis rates of lymphocytes in the progress of aging and interventional effect of ef on aged rats
liu xiaoyu, shen ziyin, wu bin, huang jianhua, xia shijin, chen weihua.
department of tranditional chinese medicine,tenth peoples hospital of tongji university,clinical medicine center of cardiocerebrovascular chinese medicine in shanghai,shanghai 200072, china
［abstract］objective:compare the apoptosis rates of lymphocytes in the progress of aging rats and interventional effect of ef.methods:the lymphocytes derived from sd rat spleen were employed as the studyed cells and were observed by flow cytometry. the differences of apoptosis rates in groups from 3d to 27m were emphasized in the study. the aim of this study of effect of ef on excessive apoptosis of aging rats was to found foundation for the following study.results:3day newborn rat group had the lowest apoptotic percentage.the extent of apoptosis correlated with prolongation of age but an exception in 10m group, which had a lower apoptotic percentage than 4m group. the highest apoptotic percentage existed in 27m. when intervened with ef, the apoptosis ratio of 27m group apparently decreased to the level between 10m and 18m. all of the data were statistically significant(p<0.05 or p<0.001).conclusion:the apoptosis rate of rat lymphocytes gradually has been increased and correlated with the time of aging. nfкb plays a key role in aging. ef could inhibit the excessive apoptosis of lymphocytes in aged rats.
［key words］epimedium kereanum nakai total flavonoids；flow cytometry；apoptosis；immuno senecense
细胞凋亡是细胞保持自身稳定、调控细胞增殖和死亡之间平衡的基本生物学过程,在衰老进程中不同年龄段细胞凋亡的速率与程度均有所区别。WWW.11665.COm中医药在干预调节细胞凋亡的过度或不及方面，有着独特优势，我们以往研究已经证明ef能显著拮抗大鼠t细胞过度凋亡现象，并且补肾方可通过协调相关促凋亡基因与抗凋亡基因表达的调控模式，重塑基因良性平衡而改善免疫衰老［ 14］。本研究拟在前期工作基础之上，着重比较研究从出生后3天直到27月龄的衰老过程中各代表性年龄段细胞即刻凋亡率的差异，并继续观察ef对老年大鼠过度细胞凋亡的影响作用。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
采用辽宁产朝鲜淫羊藿，由上海市医药工业研究院中药室提取淫羊藿总黄酮（epimedium kereanum nakai total flavonoids，ef），ef纯度为65%左右，临用前用蒸馏水配制成3 g/100 ml的溶液备用，每天按0.06 g/kg灌胃；淋巴细胞分离液（cl5045，cedarlane）； annexinvv fitc细胞凋亡检测试剂盒1（bd bioscience）。
1.2 主要仪器
流式细胞仪（becton dickinson，usa）；激光器innova905，功率15 mv，波长488 nm，仪器型号：facscalibur；洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；dk8d型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；低温离心机（上海安亭科学医学仪器厂）；图像分析软件(cellquester)。
1.3 动物与分组
清洁级健康雄性sd大鼠60只，由复旦大学动物科学部提供，随机分为3d组（出生3天）、4m组（4月龄）、10m组（10月龄）、18m组（18月龄）、27m组（27月龄）、27m+ef组，每组各10只。自24月龄开始，27m+ef组予ef（每天按0.06 g/kg，融于5 ml蒸馏水中）灌胃，27m组给予等量蒸馏水灌胃，连续3个月。其余各组常规喂养。
1.4 脾淋巴细胞制备
无菌摘取脾脏，在超净台中分离脾脏淋巴细胞［1］。
1.5 脾淋巴细胞凋亡监测
采用流式细胞仪，annexin v凋亡检测试剂盒监测脾脏淋巴细胞百分率，步骤如下：pbs洗涤细胞2次，以1×binding buffer调整细胞浓度为1×106 cells/ml；取100 μl样品，加入5 μl annexin v和5 μl pi；轻微混匀细胞，25℃暗室孵育15分钟；每份样品加入100 μl 11×binding buffer；流式细胞仪检测分析annexin v（+）、pi（-）的细胞百分率，得到的结果分为4部分：存活细胞、死亡细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞，本研究采用细胞凋亡率是早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总凋亡率之和。
1.6 统计分析
采用spss统计软件分析，统计结果以x±s表示，计量资料用方差分析：方差齐用lsd检验，方差不齐用tamhane检验；p<0.05为有显著性差异。
2 结果
各年龄段大鼠脾淋巴细胞即刻凋亡百分率比较见表1和图1。结果显示，在各年龄段淋巴细胞凋亡百分率比较中，刚出生3天组的凋亡率最低，整个趋势是随着增龄，细胞凋亡率逐渐升高，仅10m组例外（其凋亡率小于4m组），27m组细胞凋亡率最高，与以往研究相符。ef干预后，27m组细胞凋亡率明显下降，介于10m组与18m组之间水平。表1 各年龄段大鼠淋巴细胞即刻凋亡百分率比较及ef的干预作用（略）
3 讨论
从胚胎发育到死亡的整个生命过程与细胞凋亡密切相关,因此细胞凋亡是双相的，既是机体发育的正常过程，也是由于细胞凋亡过速随时间推移而形成的退行性变化,病理情况下细胞凋亡过缓还可能导致癌变等变化。机体细胞凋亡与抗凋亡作用相互协调，相互联系构成信号网络,最终细胞是凋亡还是生存取决于各种信号分子的协同作用结果。
正常免疫系统发育的结局，既形成了有免疫活性的淋巴细胞，又产生了对自身抗原的免疫耐受。而其耐受机制的形成，主要靠识别自身抗原的t淋巴细胞克隆的程序性细胞死亡机制的活化。正常t淋巴细胞在受到入侵抗原刺激后激活，诱导出一系列的免疫应答反应。机体为了防止过高的免疫应答，或防止这种免疫应答无限制地发展下去，便有细胞凋亡来控制激活t细胞的寿命。生物衰老进程中显著的年龄相关性免疫功能的衰退大都由于t淋巴细胞功能障碍所致。随着增龄，胸腺退化与萎缩，外周淋巴器官中t细胞总数显著减少。同时伴有t细胞和b细胞亚体数目的减少，t细胞增殖能力减退，活化途径失控、对凋亡敏感性增高,对很多种刺激应答减弱。我们对sd大鼠脾脏分离的淋巴细胞的即刻凋亡率研究结果显示，在衰老进程中，刚出生3天组的细胞凋亡率最低，随着增龄，细胞凋亡率逐渐升高，这与生命发育衰老的渐进性变化是基本相符合的。
免疫衰老进程中t淋巴细胞凋亡相关信号网络中分子表达的良性平衡，能使大多数因压力超负荷而改变的基因表达恢复到正常水平，可以促进老年免疫稳态的重建。但在衰老的不同阶段,表达变化占主导地位的基因群组是不同的。因此如何使细胞凋亡得以适当抑制，使衰老相关变化得以延缓，最终获得寿命延长，是每一个衰老研究者所执着追求的理想目标。我们课题组在补肾药物调控细胞凋亡方面已取得了一定成绩，多次实验均证明补肾复方及ef可显著降低老年大鼠的淋巴细胞凋亡，并且还通过淋巴细胞基因表达谱的研究证明ef可以在上调抗凋亡基因表达的同时，下调促凋亡基因的表达；上调促增殖基因表达的同时，下调抗增殖基因的表达，从而重塑衰老进程中基因表达的良性平衡，使整合后的基因表达体现出抗凋亡、重建免疫稳态的生物学效应,体现了多基因、多途径的整体调节优势。本次实验重复验证了ef对老年大鼠淋巴细胞过度凋亡状态的有效抑制作用,并且进一步证明，ef干预之后的27m组细胞凋亡率可明显下降至介于10m与18m之间水平，这与我们在后续的系列研究中对免疫衰老的整体调控效应是一致的。
【参考文献】
1 刘小雨,沈自尹,黄建华 et al. 淫羊藿总黄酮经由核因子κb相关信号转导途径调控免疫衰老机制 ［j］.中国中西医结合杂志,2006;26(7):620624.
2 郭为民，沈自尹，陈 瑜 et al.补肾法延缓免疫衰老的临床与实验研究 ［j］.中国中西医结合杂志,2002;22(3):1215.
3 沈自尹,陈 瑜.淫羊藿总黄酮与补肾复方对皮质酮大鼠t细胞凋亡相关基因群调控的对比研究 ［j］.中国免疫学杂志,2002;18(3):187190.
4 沈自尹,郭为民,陈 瑜.补肾方对老年人t细胞凋亡相关基因群转录的调控模式研究 ［j］.中国老年学杂志,2002;22(4):241243.
