菟丝子复方制剂对衰老小鼠心肌cyt c和caspase3的影响
【关键词】 菟丝子;细胞色素c;caspase3;细胞凋亡
【摘要】 目的 研究菟丝子及其复方制剂对衰老小鼠心肌细胞色素c(cyt c)、caspase3活性及心肌细胞凋亡的影响作用机制。方法 40只雄性昆明种小鼠，随机分为青年对照组、衰老模型对照组、菟丝子治疗组、菟丝子复方制剂组。采用d半乳糖注射法制作衰老模型，然后灌服菟丝子水煎剂及复方制剂治疗7 w。使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，采用酶联免疫标记法测定cyt c含量、分光光度法检测caspase3活性。结果 衰老模型组与青年组比较，心肌组织cyt c释放增加(p<0.01)，caspase3活性增加(p<0.01)，心肌细胞凋亡增加(p<0.01);菟丝子及其复方制剂组与模型组比较，能够减少胞浆cyt c含量(p<0.01)，降低心肌细胞内caspase3活性(p<0.05)，抑制心肌细胞凋亡(p<0.05)。与菟丝子组比较，其复方制剂的效果与菟丝子没有显著差异(p>0.05)。结论 菟丝子及其复方制剂可能通过减少线粒体cyt c的溢出，降低caspase3活性，从而减少衰老模型小鼠心肌细胞的凋亡率。菟丝子是菟丝子复方制剂发挥作用的主要成分。
【关键词】 菟丝子;细胞色素c;caspase3;细胞凋亡
中国传统医学证明菟丝子具有补阳益阴，固精缩尿等作用〔1〕。WwW.11665.com现代药理学研究表明，菟丝子还具有调节免疫，抗衰老，生殖系统保护，代谢调节，保护心血管系统，营养神经因子，抗疲劳及耐缺氧等作用〔2〕。其作用可通过减少自由基生成，促进超氧化物歧化酶(sod)、还原型谷胱甘肽(gsh)生成。还能通过增高血清中的钙离子，抑制l型钙通道，控制钙内流〔3〕，调节骨质疏松〔4〕、抑制脑细胞凋亡〔5〕。但关于菟丝子对心肌细胞凋亡的影响及其作用机制的研究目前尚未见报道。本实验利用酶联免疫方法、流式细胞术等研究方法，观察菟丝子复方制剂干预衰老小鼠心肌细胞凋亡作用的可能机制，旨在探讨菟丝子及其复方制剂对衰老模型小鼠心肌细胞的保护作用，为实现中药有效防治心肌细胞凋亡的中药提供实验数据和理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验药物
菟丝子、茯苓、丹皮、泽泻、枸杞子购于大庆福源饮片加工销售有限公司，批号080918。取菟丝子40 g加入300 ml蒸馏水中，浸泡60 min,煎煮两次，混合后定容至100 ml，制成含0.4 g生药/ml的提取液。取菟丝子60 g、茯苓40 g、泽泻40 g、丹皮40 g、枸杞子40 g ，浸泡于600 ml的蒸馏水中，煎煮两次后定容至150 ml,制成菟丝子终浓度为0.4 g生药/ml的菟丝子复方制剂提取液，备用。
1.2 试剂
d半乳糖，北京索莱宝生化试剂公司，批号：d8310。 细胞色素c(cyt c)测定试剂盒adl。annexinvfitc/p凋亡试剂盒，beijing solar bioscience &technology co ltd。半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)购自碧云天，余试剂为国产分析纯。
1.3 实验方法
1.3.1 实验分组及给药
昆明种雄性小鼠40只，体重(20±2)d，按体重随机分为四组，即青年对照组、衰老模型对照组、菟丝子组和菟丝子复方制剂组。每组10只，小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由进水饮食，温度18～20℃。除青年对照组每日注射生理盐水外，其他组每日中午按100 mg/kg皮下注射d半乳糖造模，连续注射30 d，制成衰老模型。然后， 青年对照组和衰老模型组灌服等同于其他中药给药量的温开水，菟丝子组和菟丝子复方制剂组按照4 g·kg-1·d-1灌服菟丝子提取液和菟丝子复方制剂液。连续给药42 d。于最后一次给药后第2天处死动物，迅速取出心脏，切下左心室迅速分离细胞，其余做成匀浆，备用。
1.3.2 分离心肌细胞
将剪下的心肌放入盛有dhanks溶液的平皿中，用dhanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心室剪成1 mm3大小的碎片，再将心室碎片转移至离心管中，加5 ml左右消化液，37℃消化5 min，自然沉淀，弃上清，再加5 ml左右消化液，37℃消化20 min(每隔2 min振摇几下)，用吸管吹打1 min 后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2 ml冷的培养液终止消化，1 000 r/min离心5 min ，弃上清，沉淀中加入dhanks溶液2 ml， 1 500 r/min离心10 min ，弃上清，沉淀中加入培养液2 ml，用吸管吹打制成细胞悬液。上述未消化完全的心室碎片补加5 ml左右消化液后继续消化，同样操作。心肌细胞计数在各次消化所得的细胞沉淀中加入培养液，集中混匀制成悬液，进行细胞计数，用吸滴管吸取细胞悬液少许，弃去第1滴后滴于血细胞计数板上，计测细胞数，细胞密度为5×105个/ml。
1.3.3 指标的测定
将剪碎的心肌组织倒入玻璃匀浆管中，用匀浆介质冲洗，于4℃制成10%的匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清，用于检测cyt c、caspase3活性的检测;分离的心肌细胞用annexinvfitc方法，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.4 统计学分析
采用spss17.0 软件进行单因素方差分析，实验数据均以x±s表示，两组间比较采用t检验。
2 结 果
与青年对照组相比，模型组小鼠心肌cyt c含量和caspase3活性显著升高(p<0.01)，心肌细胞凋亡指数升高(p<0.05)，菟丝子组、菟丝子复方制剂组小鼠cyt c含量、caspase3活性、心肌细胞凋亡指数明显下降(p<0.05)。见表1。表1 菟丝子对衰老模型小鼠心肌cyt c、caspase3、心肌细胞凋亡的影响
3 讨 论
d半乳糖致亚急性衰老动物模型常用来研究老年性疾病，能较好的模拟与自然衰老相似的代谢紊乱特征，使心脏等组织受到损伤，产生衰老现象〔6〕。而细胞凋亡在生物进化、内环境稳定以及多个系统的发育中起着重要作用〔7〕。细胞凋亡由复杂的信号网络系统控制，目前已知主要有3条通路： 线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。在凋亡的信号通路中，线粒体起到了枢纽作用，被认为是细胞凋亡的核心〔8〕，线粒体内钙超载使线粒体膜电位改变，在凋亡信号的刺激下，线粒体膜结构发生变化，将膜间隙(ims)多种可溶性蛋白质释放入细胞浆，其中包括cyt c、凋亡诱导因子(aif)和caspases酶原等〔9〕，从而通过激活caspase通路引起细胞凋亡〔10～12〕。
本研究结果表明衰老模型小鼠心肌细胞胞浆cyt c明显增加。在正常情况下，cyt c存在于线粒体内膜外侧，说明在衰老的情况下，cyt c由线粒体释放入胞浆使胞浆内含量增加。而cyt c具有调控细胞能量代谢和凋亡的双重功能，它既能通过对细胞能量代谢的调节，调控细胞死亡的方式，又能通过对凋亡信号的转导和放大作用，直接介导细胞凋亡〔13〕。本实验中还发现衰老小鼠心肌细胞中cyt c 增加的同时caspase3活性也增加，从而引起心肌细胞凋亡。caspase3被认为是各种凋亡刺激因子激活的caspase家族中的关键蛋白酶，活性caspase3可作用于一些其他caspase成员，并降解凋亡细胞中的某些蛋白质。线粒体cyt c的释放，激活了caspase家族，引起凋亡〔14〕。菟丝子及其复方制剂可使线粒体cyt c含量、caspase3活性下降，心肌细胞凋亡指数减少，这说明菟丝子能够有效地减少心肌细胞凋亡率，其作用可能是通过抑制心肌细胞线粒体释放cyt c，从而抑制casepases级联反应进而延缓心肌细胞的衰老。此外，还可能的通过使线粒体膜电位发生改变，减少线粒体膜的损伤，从而减少线粒体cyt c释放，进而抑制caspase3活性，实现其抑制心肌细胞凋亡的作用。根据本研究结果，认为菟丝子可通过减少心肌细胞线粒体cyt c释放，降低caspase3活性而抑制心肌细胞的凋亡。即通过线粒体途径抑制衰老小鼠心肌细胞凋亡，而菟丝子复方制剂与菟丝子二者作用，没有显著差异(p>0.05)。说明菟丝子复方制剂中抑制心肌细胞凋亡的主要成分是菟丝子。此外，菟丝子对心肌细胞凋亡影响的作用机制还可能存在其他的作用途径，这有待于进一步深入研究。
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