作者：曹阳，吕刚，于洋，范仲凯

【摘要】  　　目的 研究骨髓基质细胞的cxcr4表达，分析其表达规律。为改善和提高骨髓基质细胞的增殖和迁移能力寻找更有效的途径。为临床骨髓基质细胞更广泛的应用奠定基础。方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，观察其增殖及生长特性，应用免疫组化和rt-pcr方法对mscs的cxcr4受体及cxcr4 mrna表达水平进行检测，并应用神经胶质细胞进行对比，探讨其表达异常的因素。结果 骨髓基质细胞cxcr4m rna表达水平稳定，cxcr4在各代骨髓基质细胞中表达小于5%，且随传代数增加而减少。结论 cxcr4在骨髓基质细胞中表达量很少，如果促进其cxcr4表达将会极大增强骨髓基质细胞的增殖与迁移能力。

【关键词】  骨髓基质细胞 趋化因子受体cxcr4 迁移

　　abstract: objective  to study the expression of chemokine receptor cxcr4 in bone mesenchymal stroma cells and to analyze its regularity. methods  through observation of the proliferation and growth characteristics of the cultured rat bone mesenchymal stroma  stem cells, and application of  immunohistochemistry and rt-pcr method, testing of the  cxcr4 receptor of mscs and the expression level of cxcr4mrna  were carried out, and  glial cells were used as the contrast to explore its abnormal factors of expression.results　the expression level of cxcr4mrna in bone mesenchymal stroma cells was stable, cxcr4 in the bone mesenchymal stroma cells of every generation was less than 5%, and appeared to decline with increase of generation. conclusions  mscs can expresses cxcr4, but the positive ratio is very low.  if the level of cxcr4 expression is raised, the ability of proliferation and transfer will be improved.
   
　　key words：bone mesenchymal stroma cells(mscs); chemokine receptor cxcr4; transfer

　　骨髓基质细胞(bone mesenchymal stroma cells, mscs)是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，具有分化成各种间叶组织细胞的潜能。www.11665.COm骨髓基质细胞可以向骨细胞、软骨细胞、神经细胞转化。目前可以用多种方法分离、扩增，并且可以使用病毒载体进行基因层面的修饰。通过骨髓基质细胞释放各种因子可以促进血源性干细胞、神经源性干细胞、上皮细胞等的增殖。
   
　　虽然体外分离mscs及定向诱导是mscs应用的前提，但对干细胞的增殖、迁移的调控比控制分化更为重要，可以这么说：首先是有增殖、迁移，然后才有分化。这些治疗策略成功的关键（骨、软骨、神经）是足够的移植量。到目前为止，结果显示尽管骨髓基质细胞能够移植到这些组织，但是移植量的水平却是有限的，如果需要达到大的治疗功效则需要更高水平、更大量的干细胞增殖和迁移到靶器官。
   
　　目前研究发现干细胞趋化因子stromal-derived factor-1 (sdf-1)及其受体cxcr4对干细胞动员、迁移、细胞归巢起到重要作用，已知cxcr4在造血干细胞、cd34+等细胞中高度表达，此过程受到微环境的调控，组织释放的趋化因子以及相关物质通过干细胞表面黏附分子以及cxcr4信号途径来起作用，协助干细胞成功跨越内皮细胞［1］。虽然cxcr4在造血干细胞中的表达是肯定的，但在mscs中表达程度尚有争论。本研究将通过动物实验对cxcr4在骨髓基质细胞中表达进行检测，分析影响其表达机制。
   
　　1  材料
   
　　co2培养箱(heraeus)，超净工作台(nuair)，倒置相差显微镜(olympus)，低速离心机(heraeus)，胰蛋白酶(sigma)。酶标仪(bio-rad model 550，biol-tiok公司)、台式高速低温离心机(avantitm j-30i centrifuge，beckman公司)、振荡仪(wsz-100-a),37 ℃孵箱，dmem培养液(gibco，boster )，胎牛血清(boster)，3 月龄雄性sd大鼠，兔抗鼠cxcr4多克隆抗体 (boster公司)，免疫组化(sp)试剂盒(boster公司)， rnain、rnaout（北京天来生物公司），rt-pcr试剂盒（toyobo），cxcr4，actine引物合成（sangon），兔抗鼠多克隆抗体cd34，cd44，cd45，cxcr4（boster）。
   
　　2  方法

　　2.1  骨髓基质细胞分离和培养  大鼠颈椎脱臼处死后，取其双侧股骨和胫骨。在超净台内剪断上下干骺端，用含10%胎牛血清的dmem注射器插入骨髓腔冲洗，将骨髓细胞冲入培养皿中，用dmem培养液冲洗，轻轻吹打，然后加入适量的dmem(含10%胎牛血清)，置37 ℃， 5% co2培养箱培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。2 天后换液，以去除未贴壁的血细胞，以后每隔3 天换液1 次。培养细胞铺满后用0.25%胰蛋白酶1∶2消化传代。免疫组织化学方法对mscs进行鉴定。

　　2.2  reverse-transcription-polymerase chain reaction (rt-pcr)检测mscs中cxcr4 mrna表达  培养2、3、4、5代mscs和星形胶质细胞（可稳定表达cxcr4，阳性对照），用rnain和rnaout试剂盒保存提取组织总rna。紫外分光光度计检测rna的纯度及浓度。应用pcr试剂盒扩增cxcr4，同时扩增actin作为内参，cxcr4引物序列：sense (5'-3') ：ggtctggagactatgactcca；antisense(5'-3')：gtgctggaactggaacacca。操作程序：在反应管中制备以下反应液：rnase free h2o 19 μl，5×reaction buffer 10 μl，2.5 mm dntps 6 μl，25mm mn(oac)25 μl，引物各2 μl，10 u/μlrnase inihibitor 2 μl，2.5 u/μl rtth dna polymerase 2 μl，rna 2 μl；加入矿物油50 μl；设置热循环仪，按照以下程序进行反应：60 ℃ 30 分钟，94 ℃ 2 分钟；94 ℃ 2 分钟，60 ℃ 1.5 分钟(40 个循环)；60 ℃ 7 分钟；回收pcr产物，使用琼脂糖凝胶电泳分离紫外灯下观察并拍照。图像分析：运用德国ftcaq5501w 图像分析仪对rt-pcr图像分析。计算条带的积分吸光度，分别采用cxcr4与actin积分吸光度比值表示其含量。

　　2.3  免疫组织化学检测mscs中cxcr4表达  poly-lysine玻片防脱片剂处理，取2～10代mscs细胞制成细胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，30%h2o2 1 份+蒸馏水10 份混合，室温5～10 分钟。蒸馏水洗3 次。滴加5%bsa封闭液，室温20 分钟。甩去多余液体。滴加稀释的一抗（cd34：1∶200、cd44：1∶200、cd54：1∶200、cxcr4：1∶100），37 ℃  1 小时。pbs洗2 分钟×3 次。滴加生物素化山羊抗兔igg，37 ℃ 20 分钟。pbs洗2 分钟×3 次。滴加试剂sabc，37 ℃ 20 分钟。pbs洗5 分钟×4 次。使用dab显色试剂盒(ar1022)显色。蒸馏水洗涤。脱水，透明，封片。同样方法对神经胶质细胞中cxcr4检测进行对照。显微镜观察。mscs细胞表面cxcr4的检测：以细胞胞浆中显示棕黄色颗粒定为阳性反应。每张涂片计数100个细胞；依细胞的反应强度计分（0～4分)，计算细胞的平均反应强度的积分值（%）。

　　2.4  统计学方法  应用excel 2003统计软件对实验数据进行统计学分析。

   
　　3  结果

　　3.1  原代培养骨髓基质细胞约24～48 h贴壁，细胞初为淋巴细胞样小圆细胞。约7～10 d可铺满培养皿，细胞融合成单层。此时细胞为多角形、三角形或梭形，呈集落状生长。传代培养原代细胞逐渐伸展为梭形、三角形、多角形，胞体较原代略膨大，有胞浆突起，成旋涡或平行状排列。5～7 d即可长满(图1)。mscs鉴定： rmscs免疫组化显示cd34、cd45表达阴性，cd44、cd54表达阳性，第5代mscs特异性表面标志物cd44， cd54表达率分别是99.5%,98.1%，(图2)。

　　3.2  cxcr4表达  免疫组化显示mscs有cxcr4抗原表达，2代阳性率5.2%（图3），以后逐渐减少、减弱，3代1.6%，4代1.1%，5代以后几乎无阳性表达（图4）。
   
　　rt-pcr检测到mscs有cxcr4的mrna表达，a为阴性对照（使用正常pcr扩增，但不加引物），b为dnamarker，c为胶质细胞cxcr4表达（阳性对照），d为mscs的cxcr4表达，e为actin；各代cxcr4mrna表达方差分析表达量和传代数无明显区别（p>0.05），（图5）。
   
　　结果表明mscs有cxcr4蛋白表达，并随传代次数增加而减少。5代后几乎不表达cxcr4蛋白。mscs有少量cxcr4的mrna表达，表达量和传代数无明显区别。
   
　　4  讨论

　　4.1  1993年tashiro等构建了一个bm基质细胞系的cdna文库，并克隆出两个编码细胞因子的cdna:sdf-1α和sdf-1β，它们与巨噬细胞炎性蛋白同属一个家族。sdf-1与il 7共同作用可支持依赖基质细胞的前b细胞克隆-dw34的增殖，表明它属于趋化因子cxc亚家族的一个成员，sdf-1的受体cxcr4是一个g蛋白偶联受体，northern分析发现，许多非造血组织和器官中均有cxcr 4 mrna的表达，胸腺、脾脏和淋巴结中表达水平尤其高。sdf-1／cxcr4轴在干／祖细胞归巢中起到重要作用［2］。因此sdf-1／cxcr4对干细胞的增殖和迁移的重要性越来越受到重视。近年来研究也发现cxcr4和配体sdf-1相互作用构成机体内一个重要的反应轴参与了某些肿瘤的抑制和进展［3］。

　　4.2  pittenger［4］等观察到人mscs体外培养12 代仍能保持正常的染色体表型和端粒酶活性。bruder等研究表明，人骨髓mscs在原代培养的初始约为500个/培养瓶，到原代培养末期能扩增到6×105。传代后以这种几何级数的扩增能持续10 代左右。由细胞活性分析可以看出，5 代以后细胞活性开始减低，因此使用5 代以前的细胞进行移植等应用效果更佳。本实验结果可以看到骨髓基质细胞表达cxcr4也是随着传代数增加而减少，可能和细胞活性降低有关。因此提示临床应用骨髓基质细胞治疗应选用近代细胞为佳。

　　4.3  对于mscs中的cxcr4表达，在原代培养过程的mscs就表达cxcr4的受体，此时mscs分泌的sdf-1对于mscs起作用并可以使mscs进行定向迁移，这在干细胞在诸如心梗或骨外伤等疾病时的mscs的迁移修复作用是有重大意义的。但为什么mscs表达cxcr4水平存在争议，可能和mscs所处细胞周期有关，快速增殖的mscs细胞呈现高表达cxcr4，同时又看到细胞cxcr4免疫组化和mrna表达变化并不完全一致，可能是和转录后的修饰有关［5］，有可能是由其自身分泌的sdf-1所起作用，本研究中rt-pcr与免疫组化结果存在不一致性考虑是多种原因造成的：mscs也许是由两种（或多种）混杂的细胞（快速增殖及慢速增殖细胞）所表达，同时也提示目前所建立的mscs培养细胞不是一种单纯的细胞系。细胞可转录cxcr4 mrna，但转录后的调控机制使其不翻译或仅翻译极低水平的蛋白，故免疫组化不能完全检测到其表达。有研究用western blot分析，数据表明有cxcr4受体表达，但可能是以糖基化形式存在［6］。

　　4.4  目前许多研究表明sdf-1／cxcr4轴也参与了肿瘤的发生发展,并与肿瘤转移密切相关 。一些研究推断，表达cxcr4的肿瘤细胞转移到骨髓和淋巴结等其机制就类似于cxcr4 造血祖细胞归巢。迄今为止，sdf-1／cxcr4生物学轴在肿瘤转移中的作用已分别在乳腺癌、非小细胞肺癌和前列腺癌等多种肿瘤的研究中得到证实，其分子机制可能是高表达cxcr4的肿瘤细胞在sdf1趋化和牵引下，逆浓度梯度转移至作为配体产生源的某些器官,从而形成器官特异性的转移［7,8］。这同样提示cxcr4对于干细胞的增殖与迁移的相关作用，也使我们在应用cxcr4控制骨髓基质细胞的迁移的同时也应注意避免变异向肿瘤方向发展的可能。

　　4.5  骨髓基质干细胞移植后，细胞迁移和增殖水平对于损伤部位是非常重要的，但是目前发现其作用是很小的。如何提高在治疗区域的细胞含量是提高临床治疗疗效的关键。stromal-derived factor-1 (sdf-1)被证明对干细胞的迁移起到重要作用，同样也是骨髓基质细胞迁移的关键因素，因此提高其配体cxcr4在骨髓基质细胞中的表达，将会对其增殖、迁移起到促进作用。本研究提示cxcr4存在于骨髓基质细胞，在细胞表面表达很少。如果能够动员细胞内部受体，增加其表达将会提高骨髓基质细胞的募集，为其临床应用提供广阔前景。

【参考文献】
  　　［1］ wysoczynski m, reca r, ratajczak j. incorporation of cxcr4 into membrane lipid rafts primes homing-related responses of hematopoietic stem/progenitor cells to an sdf-1 gradient［j］. blood, 2005 jan 1，105(1):40-48.

　　［2］ ohno n, kajiume t, sera y. short-term culture of umbilical cord blood-derived cd34 cells enhances engraftment into nod/scid mice through increased cxcr4 expression［j］. stem cells dev, 2008 dec， 29:103-108.

　　［3］ fukunaga s, maeda k, noda e. association between expression of vascular endothelial growth factor c, chemokine receptor cxcr4 and lymph node metastasis in colorectal cancer［j］. oncology，2006 jun，71:204-211.

　　［4］ lee k, majumdar mk, buyaner d, et al. human mesenchymal stem cells maintain transgene expression during expansion and differentiation［j］. mol ther， 2001 jun，3(6):857-866.

　　［5］ von lüttichau i, notohamiprodjo m, wechselberger a. human adult cd34- progenitor cells functionally express the chemokine receptors ccr1, ccr4, ccr7, cxcr5, and ccr10 but not cxcr4［j］. stem cells dev，2005 jun，14(3):329-336.

　　［6］ robert f, wynn, claire a. a small proportion of mesenchymal stem cells strongly expresses functionally active cxcr4 receptor capable of promoting migration to bone marrow［j］. blood, 2004 november, 104: 2643-2645.

　　［7］ akashi t, koizumi k, tsuneyama k. chemokine receptor cxcr4 expression and prognosis in patients with metastatic prostate cancer［j］. cancer sci，2008 mar，99(3):539-542.

　　［8］ corcoran ke, malhotra a, molina ca. stromal-derived factor-1alpha induces a non-canonical pathway to activate the endocrine-linked tac1 gene in non-tumorigenic breast cells［j］. j mol endocrinol， 2008 mar，40(3):113-123.