作者：孙娟,黄水清,马文静,孙璐
【摘要】 【目的】 观察当归补血汤含药血清对氧化低密度脂蛋白(oxldl)激活小鼠单核细胞系raw2647细胞中核转录因子κbp65(nfκbp65)mrna表达的影响。【方法】将新西兰兔8只随机分为空白血清组和含药血清组,每组各4只，分别灌胃生理盐水和当归补血汤水煎液(剂量为84 g·kg-1·d-1),分离血清。将raw2647细胞悬液接种于培养瓶中,培养24 h,分为空白对照组、oxldl组、par组(终浓度为10 μmol/l的小菊白内酯)、体积分数10%的含药血清组。除空白对照组外，其他各组分别加入100 μg/ml oxldl刺激4 h,收集细胞。采用实时荧光定量pcr法检测各组细胞nfκbp65 mrna的表达量。【结果】 oxldl组与空白对照组比较,nfκbp65 mrna的表达量增加(p< 005);含药血清组与oxldl组比较,nfκbp65 mrna的表达量减少(p< 005)。【结论】 当归补血汤含药血清能下调nfκbp65 mrna的表达量,抑制、阻断nfκbp65的表达可能是当归补血汤抗动脉粥样硬化的作用机制之一。
【关键词】 当归补血汤/药理学;动脉粥样硬化/中药疗法;信号转导;基因表达调控;细胞培养
动脉粥样硬化(atherosclerosis, as)是导致心脑血管疾病发生的重要病理改变,而氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein, oxldl)对as的发生发展起着非常重要的作用。wwW.11665.CoM在动脉内膜下,低密度脂蛋白经氧化修饰成oxldl,后者可以抑制低密度脂蛋白与其受体结合,抑制巨噬细胞的移动,致使局部oxldl大量堆积,形成泡沫细胞,从而加速as的形成[1]。brand等[2]发现as病灶粥样硬化斑块内膜和中膜的平滑肌细胞及巨噬细胞、内皮细胞里均有活化的核转录因子κb(nuclear factorkappa b,nfκb)。nfκb可能是启动as的关键因子[3],由血管壁ldl的修饰到引发炎症和趋化因子的释放、内皮细胞黏附分子的表达等程序导致单核细胞向待损害部位聚集,nfκb都参与了其中[4-6]。当归补血汤目前已被广泛应用于as及其相关疾病的治疗,疗效确切,具有降低血脂和抗氧化损伤的效应,能够明显减轻由oxldl引起的单核细胞的趋化作用[7-9]。为探讨该方抗as的作用机理,本研究观察了其含药血清对oxldl激活小鼠单核细胞系raw2647细胞中nfκbp65 mrna表达的影响。现报道如下。
1材料与方法
11主要仪器及试剂bna3210型co2培养箱(日本espec公司),swcj1fd型超净工作台(中国苏州净化设备公司),axiovert 200倒置显微镜(日本zeiss公司),abi3900台式高通量dna合成仪(美国abi公司),abi7300荧光定量pcr仪(美国abi公司),sigma3k18型高速低温离心机(美国sigma公司),小菊白内酯(parthenolide,par;美国santa cruz 公司,批号：sc3523),rpmi1640培养基(美国invitrogen公司,批号：12491015),胎牛血清(美国invitrogen公司,批号：10099158),逆转录试剂盒(中晶公司,批号：k1621),总rna提取试剂(trizol reagent，美国invitrogen公司,批号：15596026)。
12实验动物健康新西兰大耳白兔共8只,由广州中医药大学实验动物中心提供,许可证号：scxk(粤)20030001,雌雄各半,3～4月龄,体质量15～20 kg。
13当归补血汤水煎液的制备黄芪、当归均使用道地药材,为甘肃产品,购自广东省药材公司并加以鉴定。按照《内外伤辨惑论》原方中黄芪和当归以质量比5∶1的配伍比例称取生药,以每g生药加水6 ml,冷水浸泡30 min,煮沸后再文火慢煎40 min,趁热过滤,滤液自然滴尽,第2煎按每g生药加水4 ml,煎法同前,合并滤液,95 ℃水浴浓缩成含生药084 g/ml的水煎液，4℃保存。
14血清制备8只兔随机分为空白血清组和含药血清组,每组4只,分别灌胃生理盐水和当归补血汤水煎液,实际灌胃剂量按动物体表面积换算得出,临床等效剂量为168 g/kg,按每kg体质量每天灌胃量为5倍临床等效剂量即84 g·kg1·d1,连续灌胃3 d,第4天上午于禁食12 h后灌胃1次,1 h后乙醚麻醉动物,无菌条件下心脏采血,将抽取的血液室温下静置3 h,离心,取上清,56 ℃水浴中灭活,022 μm微孔滤器过滤除菌,-70 ℃保存备用。
15细胞培养将raw2647细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的rpmi1640培养液中,置于37 ℃ 、体积分数5% 的co2培养箱中培养,2 d换液1次。细胞长满单层后可传代,用25 g/l的胰酶乙二胺四乙酸消化处于生长旺盛期的单层培养细胞,再用含体积分数10%胎牛血清的rpmi1640培养基终止消化,1 000 r/min离心5 min,收集细胞,制成细胞悬液,细胞计数,调整细胞密度为3×104 /cm2,再培养。
16实时荧光定量pcr法检测raw2647细胞中nfκbp65 mrna的表达量从gen bank上查找和对比目的基因,设计引物：mouse gapdh：上游引物5aacagggtggtggacctcat3;下游引物5gggatagggcctctcttgct3。mouse nfκbp65：上游引物5acgcggattcctgtacacct3;下游引物5caggagctccacaggacaga3。合成引物。
17实验分组及处理实验分为空白对照组、oxldl组、par组、含药血清组。调整细胞悬液密度5×104/cm2,按分组接种于24孔板中,每组4个复孔。在37℃ 、体积分数5% co2饱和湿度下培养24 h。弃去原培养液，以磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤细胞2～3次。空白对照组、oxldl组加含体积分数10%空白血清的rpmi1640培养液孵育24 h;par组加含体积分数10%空白血清的rpmi1640培养液孵育24 h,再加入终浓度为10 μmol/l par预处理2 h;含药血清组加含体积分数10%含药血清的rpmi1640培养液孵育24 h。除空白对照组外,其他各组分别加入100 μg/ml oxldl刺激4 h。抽提rna：弃原培养液,不洗,每孔各加500 μl 总rna提取试剂,吸打混匀。室温静置5 min。加100 μl氯仿,剧烈震荡15 s。室温静置5 min。4℃、12 000 r/min离心15 min,此时溶液分为3层,取上清液,移至新离心管中,加250 μl异丙醇,混匀,室温静置10 min。4℃、12 000 r/min离心8 min。弃上清,加入500 μl 体积分数75%乙醇洗沉淀,4℃、12 000 r/min离心5 min，风干5 min。焦碳酸二乙酯(depc)溶解沉淀,-70℃保存。逆转录反应：加rna样品11 μl,六聚物引物1 μl入pcr小管,吸打混匀。放入pcr仪中,70℃、5 min。取出加入5倍反应缓冲液4 μl、rna酶抑制剂1 μl、三磷酸脱氧核糖核苷(dntp) 混合液 2 μl,吸打混匀。放入pcr仪中,25℃、5 min。取出加入逆转录酶1 μl,吸打混匀。放入pcr仪中,25℃、10 min,42℃、60 min,70℃、10 min。荧光定量pcr反应：准备96孔板,按上述分组,每组各4个复孔,25 μl反应体系,依次加入蒸馏水101 μl、荧光染料混合液125 μl、上游引物02 μl、下游引物02 μl、样品溶液2 μl。吸打数次混匀,稍离心。放入pcr仪,95℃、15 s,60℃、60 s,进行40个循环。反应结束后,由电脑自动分析并根据标准曲线计算样品及内参的基因拷贝数。
18统计学方法结果以鸭乙肝病毒为标准品,计算样品目的 mrna拷贝数与内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh) mrna拷贝数的比值进行统计分析。数据采用spss 130 软件包进行统计分析。
2结果
raw2647细胞nfκbp65 mrna表达的变化：各组溶解曲线峰值较集中,未出现非特异性扩增(图1-c、图2-c，彩图见第556页)。各组内参照gapdh cdna扩增循环数较集中,提示各组样品浓度较接近(图2-b，彩图见第556页);各组nfκbp65 cdna扩增循环数差距明显(图1-b，彩图见第556页),提示各组nfκbp65 mrna表达量有明显差异。表1结果显示：oxldl组与空白对照组比较差异有显著性意义(p<005),提示以oxldl刺激raw2647细胞后nfκbp65 mrna表达增强。含药血清组、par组分别与oxldl组比较差异均有显著性意义(p<005),说明当归补血汤含药血清能下调nfκbp65 mrna的表达,par可明显抑制nfκbp65的表达。表1各组raw2647细胞nfκbp65 mrna表达量比较
3讨论
nfκb通路是一条重要的细胞内信号转导通路,参与了多种生理病理过程的调节。其与as的发生发展关系密切,已成为国内外学者进行抗as研究所高度重视的一个药理学作用靶点。oxldl首先激活nfκb上游激酶,引起级联反应,最终活化nfκb,使其转入核内,引起相关基因的表达,启动一系列炎症因子的基因转录,而炎症因子的过度表达又会加重nfκb的活化[10]。nfκb家族成员以不同组合形成异源二聚体,每一个nfκb蛋白均有特殊的作用,其中p65/p50异聚体在大多数哺乳动物细胞中大量存在,p65含有强转录激活结构域,与as的发生发展关系密切[11]。因此,本实验观察了当归补血汤含药血清对oxldl诱导的raw2647细胞中p65 mrna表达的影响,探讨当归补血汤是否通过nfκbp65起到抗as作用。本实验结果表明：oxldl可明显激活raw2647细胞中的nfκb通路,当归补血汤含药血清能下调nfκbp65 mrna表达。
综上所述,在as发生的早期脂质浸润、泡沫细胞形成过程中,nfκb通路发挥着重要作用,当归补血汤可能通过调节该通路以调控相关致炎因子的表达进而影响as的发生发展,抑制、阻断nfκb信号转导通路可能是当归补血汤抗as损伤作用的机制之一。
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