原文作者：王立安，侯金鑫

　　摘 要：为了优化适合工业化生产蛹虫草菌丝体的发酵条件，以菌丝体干质量或总多糖含量为筛选指标，采用摇瓶培养、发酵罐培养方法，通过正交试验对发酵配方中的n、c源，发酵过程中的接种量、接种时间进行了优化，同时，对通气量条件进行了筛选。结果显示，适合工业化生产蛹虫草菌丝体发酵培养基为：葡萄糖20 g·l-1、大豆蛋白粉8 g·l-1。发酵条件为：接种量5%、通气量1∶0.4（v/v·min）、发酵时间108 h。在上述条件下获得的发酵液菌丝体含量达到了17.16 g·l-1，总多糖含量达到1 073.82 mg·l-1。
 　　关键词：工业化生产；发酵条件；正交试验；发酵罐；发酵放大
　　中图分类号：q815 文献标识码：a doi编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.004
　　suitable optimization of the industrial production fermentation condition of cordyceps militaris aycelium
 　　hou jin-xin， duan shuo-nan， wang li-an
　　（college of life science， hebei normal university， shijiazhuang， hebei 050081， china）
 　　abstract： to optimize the fermentation conditions of cordyceps militaris mycelium which was suitable for industrial production. using the method of shake-flask culture，culture in fermenter and orthogonal test to optimize the fermentation parameter of the carbon source ，nitrogen source， inoculum size of fermentation and incubation time by mycelium dry weight and total polysaccharide content of cordyceps militaris mycelium. meanwhile， the conditions of aeration amount were screened. the results shaced that the suitable optimized medium for industrial production of cordyceps militaris mycelium fermentation was glucose 20 g·l-1， soy protein powder 8 g·l-1. fermentation conditions were as follows： 5% of the inoculum size， aeration rate of 1：0.4 （v/v·min），incubation time of 108 h. under the above conditions， whtch yield of mycelium content reached 17.16 g·l-1， the total polysaccharide content reached 1 073.82 mg·l-1 in the fermentation broth.
 　　key words： industrial production； fermentation conditions； orthogonal test； fermenter； fermentation amplification
 　　蛹虫草（cordyceps militaris）又称北虫草，是一种具有很高营养价值的食、药用真菌，其含有虫草素、虫草多糖等多种天然活性成分[1]。www.11665.cOm具有很好的抗氧化、抗衰老、清肺、益肾、抗癌等多种功效，与冬虫夏草药效相当，是冬虫夏草良好的替代品[2-6]。但是，由于人工培养的虫草子实体生长周期漫长，培养条件复杂，不能满足国内外市场的需要[7]。随着液体发酵技术的发展，通过液体发酵法培养真菌的技术逐渐成熟，目前对蛹虫草液体发酵研究的报道较多[8-12]，且发酵多采用合成培养基[13-14]或者成本较高的天然培养基[12]，对于蛹虫草工业化生产条件的探索尚未报道。本研究通过优化培养蛹虫草液体发酵条件并在最适条件下进行发酵的放大，从0.5 l的三角瓶放大到100 l的发酵罐，以期为蛹虫草发酵液的进一步生产提供借鉴参考。[论文网]
 　　1 材料和方法
　　1.1 材 料
　　1.1.1 菌种 蛹虫草由河北师范大学生化与分子生物学实验室保藏。
　　1.1.2 试剂 大豆蛋白粉（soy protein powder，spp食品级）：镇江市尚谷食品有限公司提供；马铃薯：市售；葡萄糖（分析纯）：天津市百世化工有限公司；琼脂粉（分析纯）：北京solarbio公司；浓硫酸（分析纯）：石家庄市试剂厂。
 　　1.1.3 仪器设备 zhq-100型100 l气升式发酵罐：镇江中恒生物工程设备有限公司；ql-901型漩涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；zhwy-2102型恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；756mc紫外可见分光光度计：上海菁华科技有限公司；alpha i-6型真空冷冻干燥机：西德christ公司；grx12型干热消毒箱：上海精宏实验设备有限公司；b-260型恒温水浴锅：上海亚荣生化仪器厂；avantitm j-25 i型离心机：美国beckman coulter公司；fa1104型电子天平：上海精密科学仪器有限公司。

　1.2 方 法
　　1.2.1 发酵液中菌丝干质量测定 准确量取100 ml发酵液，6 000 r·min-1离心10 min，取沉淀置于100 ℃烘箱内直至质量不再改变为止，称取菌丝质量。
 　　1.2.2 发酵液中总粗多糖检测 发酵液处理：发酵液经胶体磨和高压均质机处理后，准确量取50 ml于250 ml三角瓶中，再加入50 ml蒸馏水，常温超声水浴20 min，然后80 ℃水浴浸提4 h，抽滤，滤液定容至100 ml，sevage法[15]除蛋白。精确吸取10 ml去蛋白后的滤液。加4倍体积的95% 乙醇，摇匀，4 ℃过夜，抽滤后，将沉淀用蒸馏水溶解，定容至100 ml，苯酚-硫酸法检测[

16]。
 　　1.2.3 培养基原种培养基 pda培养基；一级液体种子培养基：液体pda培养基。
　　1.2.4 发酵条件优化的单因素试验
　　（1）葡萄糖和大豆蛋白粉添加量试验。培养条件：大豆蛋白粉4 g·l-1，葡萄糖按表1添加，接种量5%，摇床175 r·min-1恒温25 ℃培养5 d。大豆蛋白粉按表1添加，葡萄糖20 g·l-1，接种量5%，摇床175 r·min-1恒温25 ℃培养5 d。每个梯度做3个重复。
 　　（2）接种量和培养时间试验。培养条件：大豆蛋白粉4 g·l-1，葡萄糖20 g·l-1，接种量见表2，摇床175 r·min-1恒温25 ℃培养5 d。大豆蛋白粉4 g·l-1，葡萄糖20 g·l-1，接种量5%，培养时间按表2进行，摇床175 r·min-1恒温25 ℃培养。每个梯度做3个重复。
 　　1.2.5 正交试验设计 根据单因素试验结果设定l9（34）正交试验。
　　1.2.6 发酵过程的放大过程中通气量的控制 经过正交试验得出的最佳培养条件进行100 l气升式发酵罐上罐发酵。装料系数0.7，发酵温度25 ℃，通气量分别控制为1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8（v/ v·min ），spp、葡萄糖添加量、接种量按正交试验结果进行添加，ph值自然。每隔12 h取样，对发酵液品质进行检测，同时检测菌丝干质量和发酵液中胞外粗多糖的含量。
 　　2 结果与分析
　　2.1 单因素试验结果分析
　　图1 a结果显示了不同的葡萄糖浓度发酵后菌丝干质量不同，葡萄糖浓度在5～20 g·l-1区间变化时，菌丝干质量随着葡萄糖的浓度增加而增加，葡萄糖为25 g·l-1时菌丝干质量稍微有所下降，可能是渗透压过大不适于蛹虫草菌丝的生长。在葡萄糖浓度为20 g·l-1时，菌丝干质量达到最大值，为10.77 g·l-1。所以，取葡萄糖为10，15，20 g·l-1 3个浓度梯度进一步进行正交试验。
 　　图1 b结果显示了在不同spp浓度下菌丝干质量的变化情况。随着 spp浓度的增加，菌丝干质量也逐步增加，spp浓度在2～8 g·l-1时菌丝干质量增加较明显，spp浓度在8～10 g·l-1时菌丝增加量为0.08 g。综合结果和发酵成本取spp浓度为4，6，8 g·l-1 3个浓度梯度进行正交试验。
 　　图1 c结果显示了3种菌种在不同的接种量时，菌丝体干质量的变化。接种量的增加，对蛹虫草菌丝体干质量的影响不大。综合试验结果和发酵成本取5%，7%，9% 3个接种量梯度进行正交试验。
 　　图1 d 结果显示了随着发酵时间的延长菌丝体干质量逐步增加，当发酵进行到132 h时，菌丝体干质量达到最大值，为12.18 g·l-1。随着时间的继续延长，菌丝体干质量微有波动，说明发酵到达了稳定期。发酵时间的延长会增加发酵的成本，综合试验结果和发酵成本取84，108，132 h 3个时间梯度进行正交试验。
 　　2.2 蛹虫草发酵条件正交试验结果
　　正交试验经极差分析（表4）， 结果显示4个因素影响效果为：a>b>d>c。因此，蛹虫草最佳发酵工艺条件为：a3b3d1c3，即：葡萄糖20 g·l-1、大豆蛋白粉 8 g·l-1、接种量5%、发酵时间108 h。
 　　由方差分析方法得知（表5），葡萄糖含量a和大豆蛋白粉含量b对菌丝体干质量影响较大，接种量d次之，培养时间c影响最小。经两两比较得到最佳培养条件为：a3b3d1c3即：葡萄糖20 g·l-1、大豆蛋白粉 8 g·l-1、接种量5%、发酵时间108 h。
 　　2.3 在最佳条件下进行初步发酵放大
　　从图2 a中我们可以看出，当通气量在1∶0.2（v/ v·min）时菌体体生长缓慢，说明此条件下提供的氧气不足，不能使菌丝体正常生长。当通气量增大到1∶0.4（v/ v·min）以上时，菌丝体能正常生长。图2 b结果显示，当通气量在1∶0.4（v/ v·min）时发酵液中总粗多糖含量最高，说明通气量过高或者过低都不利于多糖的形成。
 　　3 结论与讨论
　　通过单因素和正交试验确定了蛹虫草最佳工业发酵条件为：葡萄糖20 g·l-1、大豆蛋白粉 8 g·l-1、接种量5%、发酵时间108 h，在此条件下得到蛹虫草菌丝干质量为：17.16 g·l-1，粗多糖含量高达1 073.82 mg·l-1，这不仅比柴建萍等[10]的16.24 g·l-1略高，而且培养条件大大节约了成本，原材料处理更加方便，添加剂得到了进一步控制，使用气升式发酵罐节约了能源。
 　　在小试放大过程中，控制通气量的变化不仅能影响菌丝体的生长，也能影响蛹虫草多糖的合成。结果中显示，当通气量过小时不利于菌丝体的生长，当通气量增加到1∶0.4（v/v·min）以上时菌丝体能够正常生长但对菌丝体总量的增加影响不大。通气量过大不利于多糖的合成，可能是过多的氧气和鼓泡运动造成了细胞的呼吸作用增强，糖流向于代谢方面更多。因此，在发酵放大过程中将通气量控制在1∶0.4（v/v·min）最合适。

　　发酵原料均为天然材料无添加剂，发酵液质量便于控制，有利于发酵液进一步开发利用。
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