原文作者：禹国龙，叶琳

　　摘 要：采用微碱法提取绣球菌多糖，通过单因素分析和l9（34）正交试验探究提取温度、提取时间、ph值、料液比4个因素对多糖提取率的影响；同时利用体外邻苯三酚自氧化法和smirnoff法对多糖进行抗氧化活性的测定。微碱法提取绣球菌多糖的最佳提取工艺条件为提取温度60 ℃、提取时间2 h、提取液ph值9、料液比为1∶30。此条件下的多糖提取率为1.7%。多糖在0.06 mg·ml-1时对羟自由基清除率达到最大，为10.5%；在0.08 mg·ml-1时对超氧阴离子自由基清除率达到最大，为21.5%。绣球菌有望成为天然的抗氧化药用真菌。
 　　关键词：绣球菌；多糖；微碱法；抗氧化
　　中图分类号：q629.12 文献标识码：a doi编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.003
　　extraction and antioxidant activity of a polysaccharide from sparassis crispa
　　yu guo-long，ye lin，yuan shi-ting，zhang li-xia
　　（college of life sciences，daqing normal college， daqing，heilongjiang 163712，china）
 　　abstract： with meningococcal polysaccharide extraction by alkali method， through the single factor analysis and l9（34） orthogonal experiment of extraction temperature， extraction time， ph value， solid to liquid ratio of four factors on the extraction rate of polysaccharide；while using in vitro adjacent benzene three phenol from determination of oxidation method and smirnoff method were antioxidant activity of polysaccharides. the alkali extraction optimum extraction conditions of sparassis crispa for polysaccharides extraction temperature 60 ℃， extraction time 2 h， extraction ph value 9， the ratio of solid to liquid 1∶30， polysaccharide under this condition the extraction rate of 1.7%. polysaccharide in 0.06 mg·ml-1 on the hydroxyl radical scavenging rate reached the maximum at 0.08 mg·ml-1 10.5%， on superoxide anion free radical scavenging rate reached a maximum of 21.5%. sparassis crispa was expected to become the natural antioxidant medicinal fungi.
 　　key words： sparasis crispa.； polysaccharide； micro alkali； antioxidant
　　绣球菌（sparassis crispa fr.） 又名绣球蘑，属无隔担子菌亚纲、无褶菌目、绣球菌科、绣球菌属 [1] ，是一种非常珍稀名贵的药食两用菌。WWW.11665.cOm多糖是绣球菌的主要活性成分，尤其是葡聚
 　　糖的含量可达40%～50%，具有抗氧化、防癌抗癌、延年益寿和增强免疫的功能[2-3]。目前，对绣球菌多糖的研究主要集中在培养栽培和水溶多糖上，通过微碱法提取多糖并对其抗氧化活性的深入系统研究却鲜见报道。笔者采用微碱法对绣球菌多糖进行提取工艺条件优化及抗氧化活性研究，旨在为绣球菌资源的开发利用提供可靠的试验依据。[论文网]
 　　1 材料和方法
　　1.1 试验材料
　　绣球菌子实体购自浙江磐安山村侬农特产有限公司。
　　1.2 主要试剂
　　95%乙醇、无水乙醇、乙醚、naoh、葡萄糖、氯仿、正丁醇、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、tris-hcl、浓硫酸、苯酚、邻苯三酚、盐酸、乙二胺四乙酸、考马斯亮蓝g250、牛血清蛋白（sigma）、葡聚糖（sigma）。所有试剂均为市售分析纯。
 　　1.3 试验仪器
　　bs 124s电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），nr-c26wf1冰箱（松下公司），通风橱（北京森雷博瑞实验室设备有限公司），hhs型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），pdz5-ws低速多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），752n紫外可见分光光度计（上海科学精密仪器厂），真空干燥器，phs-25型 数显酸度计（上海天达仪器有限公司），dhg-9245a电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
 　　1.4 试验方法
　　1.4.1 多糖的提取流程 绣球菌子实体烘干→粉碎→碱液浸泡过夜→提取（3次）→合并滤液→浓缩→脱蛋白（sevage法）→离心（3 000 r·min-1，
 　　10 min） →透析→醇沉（3倍体积95%乙醇）→洗涤（乙醇、乙醚）→干燥→粗多糖。

　　1.4.2 sevage法脱游离蛋白[4-6] 将粗多糖配制成5%的饱和溶液与 sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1（v/v））以4∶1的比例混强力振荡后离心，去除变性的蛋白质，介于提取液与 sevage试剂交界处，反复做至无游离蛋白为止。
 　　1.4.3 多糖中蛋白质含量的测定-考马斯亮兰法[7-9] 绘制标准曲线，进行样品测定。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清白蛋白的微克数，计算出待测蛋白质的含量。 样品中蛋白质含量=（所测得的蛋白质浓度×稀释倍数）/样品质量×100%。
 　　1.4.4 多糖含量测定-酚硫酸法[5] 绘制标准曲线，得回归方程和线性范围。利用回归方程计算出样品中得多糖含量，计算样品中多糖的提取率。多糖提

取率=多糖浓度×多糖质量/原料重量×100%。
 　　1.4.5 多糖提取工艺条件优化 多糖提取工艺条件优化采用单因素分析、正交试验、验证性试验进行。单因素分析试验选取提取时间（1.0，1.5，2.0，2.5，3 h；ph值=8；60 ℃；重复3次）、提取温度（40，50，60，70，80 ℃；ph值=8；2.0 h；重复3次）、ph值（ph值为7.5，8，8.5，9，9.5；70 ℃；2.0 h；重复3次）、料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶40；60 ℃；ph值=9；重复3次）4个因素，探究其对绣球菌多糖提取率的影响。在单因素分析的基础上，选择对多糖提取率影响显著的因素：提取温度（40，50，60 ℃）、ph值（ph值为7，8，9）、提取时间（2.0，2.5，3 h）、料液比（1∶20，1∶25，1∶30）4因素3水平作为研究对象，设计l9（34）正交试验（表1），探究对多糖提取率的影响。采用正交试验所确定的提取条件进行绣球菌多糖的提取，并计算多糖提取率并进行比较。
 　　1.4.6 绣球菌多糖抗氧化活性的研究 绣球菌多糖抗氧化活性的研究分别采用羟基自由基清除试验—smirnoff法[10]、超氧阴离子自由基清除试验—邻苯三酚自氧化法[10]。清除率：（a0-a）/a0×100% ，式中：a0-对照液的吸光值，a-加入多糖溶液的吸光值。
 　　2 结果与分析
　　2.1 蛋白质含量
　　根据考马斯亮蓝法测得蛋白质的标准方程为y=5.6×10-2x-1.31×10-2 （r=0.997 8）。
　　标准曲线见图1。经过测定绣球菌多糖中蛋白质含量为10.2%。
　　2.2 多糖含量
　　根据酚硫酸法测定的葡聚糖标准方程为：y=9.4 ×10-3x-1.9×10-2 （r=0.997 5）。标准曲线见图2。经过测定绣球菌多糖含量为43.8%。
 　　2.3 单因素分析试验结果
　　2.3.1 提取温度对绣球菌多糖提取率的影响 测得的多糖提取结果如图3所示。多糖在50～60 ℃提取率高，而后随着温度的升高而逐渐下降；一定范围内的温度升高有利于多糖的提取，当温度过高超出一定范围时，多糖中结合蛋白变性沉淀可能导致多糖提取率下降。
 　　2.3.2 ph值对多糖提取率的影响 测得的多糖提取结果如图4所示。随着ph值的增大，多糖的提取率增加；但当超过最适值8时，多糖的提取率下降，这可能是由于碱性过大导致多糖结构和部分蛋白质变性沉淀，造成提取率下降。
 　　2.3.3 提取时间对多糖提取率的影响 测得的多糖提取结果如图5所示。随着提取时间的增加，多糖的提取率明显增加，而后逐渐趋于平缓，当时间达到2.5 h后，多糖几乎达到最大限度的溶出率，提取率不再增加。
 　　2.3.4 料液比对多糖提取率的影响 测得的多糖提取结果如图6所示。随着料液比的增加，多糖的提取率不断增大，在料液比较低时，提取液的浓度较大，多糖的溶出率较低，不利于提取。当料液比增加到1∶20时，溶液浓度适中，多糖的溶出率较高，以后提取率逐渐趋于平稳。
 　　2.4 正交试验结果
　　通过l9（34）正交试验，获得最佳优化条件，结果见表2、表3。
　　从表2可以看出，极差越大对多糖的提取率影响越大，由大到小的顺序依次为d>c>a>b，即提取温度>ph值>提取时间>料液比。从表3可知，4个因素对提取率的影响都没有达到显著水平，因此，绣球菌多糖的最佳提取条件为a1b3c3d3，提取温度60 ℃、提取时间2 h、ph值9、料液比1∶30。
 　　2.5 验证性试验结果
　　通过验证性试验，在提取温度60 ℃、提取时间2 h、ph值为9、料液比1∶30的条件下，绣球菌多糖的提取率为1.74%。高于其它正交提取条件，说明正交试验结果有效。
 　　2.6 多糖抗氧化活性的研究结果
　　2.6.1 多糖对羟基自由基清除率的影响 根据羟基自由基清除试验，多糖对羟基自由基的清除率结果见图7。多糖对羟自由基的清除作用随多糖浓度增大而增大，但当多糖浓度继续增大，其对羟自由基的清除效果趋于平缓，达到最大值。测得多糖在0.06 mg·ml-1时抗氧化能力达到最大，清除率为10.53%。
 　　2.6.2 多糖对超氧阴离子自由基清除率的影响 根据超氧阴离子自由基清除试验，多糖对羟基自由基的清除率结果见图8。随着多糖浓度的升高，对·oh自由基的清除作用也逐渐加强，且呈现量效关系，之后缓慢下降。绣球菌多糖在0.08 mg·ml-1抗氧化能力达到最大，清除率为21.5%。
 　　3 结论与讨论
　　微碱法提取绣球菌多糖的最佳提取工艺为提取温度60 ℃、提取时间2 h、ph值9、料液比1∶30，此条件下提取率为1.7%。多糖在0.06 mg·ml-1时对羟自由基清除率达到最大为10.5%，在0.08 mg·ml-1时对超氧阴离子自由基清除率达到最大为21.5%；多糖中蛋白的含量为10.2%，糖含量为43.8%。因此，绣球菌可以作为一种新的具有抗氧化能力的药用真菌。

　　本试验中提取的多糖为碱溶性多糖，碱液的浓度会对多糖的理化性质造成影响，若要更加全面地了解绣球菌多糖的抗氧化活性，还应采用其他提取方法进行对比试验，同时对提取方法还应进一步完善和改进，以增加提取效率，为绣球菌资源的有效开发利用提供可靠依据。
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