椎间盘退变模型研究现状与进展
【关键词】 椎间盘退变 动物模型 进展
【摘要】 ：椎间盘退变疾病越来越被大家所重视，但退变的生物学机制尚不明确，构建椎间盘退变模型是研究的基础和关键。近年来国内外报道的新型椎间盘模型分为动物体外模型和动物体内模型两大类。动物体外模型包括椎间盘细胞模型和椎间盘组织块模型；动物体内模型有机械力学模型和外伤模型等。该文就近年来新型椎间盘退变模型的研究现状与进展作一综述。
【关键词】 椎间盘退变 动物模型 进展
study progress of animal model about intervertebral disc degeneration
lv ming,zhang ying,peng bao-gan.
graduated department of liaoning medical college,121001,china
abstract:the disc degeneration disease has been main research focus in spinal surgery, but the pathogenesis of disc degeneration is still not clear. appropriate animal models are important for the study of pathogenesis of disc degeneration. presently, models of disc degenetation are mainly classified into two categaries:vitro models and vivo models.the animal vitro models include disc cell models and disc tissue models.the vivo models include mechanics models and trauma models.this review tries to give a short introduction about the status and progress of animal model about disc degeneration.
key words：disc degeneration; animal model; congress
椎间盘退变性疾病(disc degeneration disease,ddd)是中老年人的常见病和多发病，随着人们劳动方式和生活方式的改变，椎间盘退变的发病正逐年上升，且有年轻化的趋势。wwW.11665.cOM虽然国内外相关研究较多，但病因和发病机制尚不完全明确。而在实验动物上复制椎间盘退变，通过对动物模型的研究，来揭示椎间盘退变的病因和发病机制等，有必要建立可靠的椎间盘退变模型。本文对国内外报道的椎间盘退变动物模型作一综述。
1 动物体外模型
1.1 椎间盘细胞模型
椎间盘细胞实验室培养技术旨在研究椎间盘细胞的生物学行为和不同刺激或干预对椎间盘细胞产生的影响。椎间盘细胞培养主要分为平面培养和三维培养。ichimura等［1］较早进行鼠髓核细胞和纤维环细胞的平面培养。preradovic等［2］进行人椎间盘髓核细胞的平面培养，发现原代细胞的ⅰ、ⅱ型胶原及蛋白聚糖(aggrecan)mrna表达水平较低，传代细胞的ⅱ型胶原及蛋白聚糖mrna水平保持稳定，但ⅰ型胶原mrna表达水平持续降低。平面培养的椎间盘细胞的形态维持不佳，活力下降快，基质蛋白表达不稳定。
在三维培养方面，gan等［3］从成年兔椎间盘分离出髓核细胞进行平面培养，传代细胞转入试管中行微粒串珠培养，发现微粒串珠培养的髓核细胞与体内髓核细胞一样，均可表达白聚糖和cd44，表达i、ⅱ型胶原，但不表达x型胶原。iwashina等［4］在低强度超声波对椎间盘细胞增殖及蛋白聚糖合成影响的实验研究中，用兔椎间盘细胞进行藻酸盐凝胶、琼脂糖和胶原凝胶。homer等［5］研究发现，胶原凝胶比藻酸盐凝胶更适于培养纤维环细胞。新型三位支架也用于椎间盘组织工程研究，如wang等［6］采用二相弹性支架材料较为先进，其外相支架由环状脱钙骨基质明胶(bmg)构成，内相支架由同心状、种入软骨细胞的聚已酸内酯苹果酸三醇(ppclm)构成，分别模拟外、内层纤维环，实验结果显示该二相支架有良好的机械强度和生物相容性。
1.2 椎间盘组织块模型
牛尾椎间盘被视为适于研究腰椎间盘的生物力学模型。牛尾椎间盘(直径为14～22 mm，厚5～10 mm)与人腰椎间盘外形相似，牛尾肌肉组织保持其椎间盘承受一定的压力，这种压力与人腰椎间盘在俯卧时承受的压力相近(0.1～0.3 mpa)。lee等［7］在体外培养牛椎间盘，并使牛椎间盘细胞的活力和生物合成能力维持了1周，但发现需在静止压力下进行培养，必须去除上下椎体终板。gantenbein等［8］提出牛椎间盘模型的改进方法，如应用周期性压力以影响其对流运输，或应用抗凝胶剂减少凝胶结构等。许多学者利用动物的椎间盘进行体外组织块培养。feng等［9］进行体外髓核组织的移植培养，发现髓核组织在培养14 d后表达ⅱ型胶原和蛋白聚糖的能力比新鲜髓核强，该模型还适用于病毒或质粒转染的研究。徐润冰等［10］用藻酸盐凝胶培养兔椎间盘组织块模型，发现烟酰胺能减轻肿瘤坏死因子(taf)-α对纤维环基质的破坏作用，这与烟酰胺可减少半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3依赖的纤维环细胞凋亡有关。此外，sawer等［11］进行鼠椎间盘培养，发现鼠椎间盘在机械力学性质上与鼠腰椎间盘存在较大差异，这在延伸颈、腰或尾部椎间盘的研究结论时必须考虑。
2 动物体内模型
2.1 机械力学模型
最常用的机械性干预为增加、减少压力负荷，增加、减少活动或损伤。在施加可变压力的模型中，压力分为持续性压力和周期性不同频率的压力。stokes等［12］进行椎间盘退变的压力和活动性之间关联的回顾性研究，指出许多机械性干预都只注意到改变压力或活动，但忽略了应用压力装置也会降低椎间盘的活动性，而这是导致椎间盘退变的原因之一。在体内机械性干预模型中，尾椎间盘因易干预、对周围组织损伤小等优点而被较多采用。小鼠、兔和牛的尾椎间盘干预模型较常用，包括早期的强迫性尾部弯曲模型、应用外部装置产生动力轴向加压模型及非对称加压模型等。动物尾椎间盘作为研究人椎间盘的模型，存有争议：①其机械负荷与人腰椎间盘有差异。通常认为动物尾部承受的压力(尤其是压缩性压力)小于人脊柱所产生的压力，但oshima等报道牛尾椎间盘的膨胀性压力与人腰椎间盘类似，并指出牛尾椎间盘的压缩性压力很可能与人腰椎间盘类似。②其解剖结构与人腰椎间盘有差异。有学者认为动物尾椎间盘较小较圆，厚度大于人椎间盘，但elliott等［13］报道指出，鼠、兔、人椎间盘的外形和机械性行为基本相似。③其生化和代谢与人椎间盘不同。
除尾椎间盘外，颈、腰椎间盘也常被用于构建体内模型。熊晓芊等［14］采用在兔腰椎间盘上、下椎体进行固定加压的可控压力退变模型来研究压力对纤维环能量代谢的影响，发现持续压力可显著提高能量代谢相关基因低氧诱导因子(hif)-1α、葡萄糖转运蛋白1(glut1)和血管内皮生长因子(vegf)的表达，这三种基因对纤维环在压力损伤下的适应和修复起重要作用。tampier等［15］对置于液压伺服测试装置上的猪颈椎间盘进行轴向和成角负荷试验，认为椎间盘退变的进展过程是从髓核沿纤维环内层小裂隙逐渐向外挤压所致，而这与纤维环损伤理论不同。
2.2 外伤模型
脊柱的力学改变和纤维环损伤在人椎间盘退变中起重要作用。流行病学研究证实，脊柱受力和椎间盘退变之间存在关联，一些动物模型中可观察到在外力经常作用的部位易发生椎间盘退变。破坏各种椎骨关节面和棘突来诱导脊柱失稳引发椎间盘退变所需要的时间不一致，且脊柱可能随着时间延长而发生纤维环性稳定，影响建模。脊柱部分融合会导致邻近节段活动增加及椎间盘退变，但构建基于这种原理的退变模型需行手术并只能诱导单节段发病，而且这种手术技术很难广泛应用于实验室。应用较广泛的手术模型是纤维环损伤模型。key等早在1948年用手术刀刺穿动物椎间盘来诱导椎间盘退变，这种刺穿模型可分为全纤维环损伤模型和浅表纤维环损伤模型，前者诱导椎间盘退变的速度较快。kim等［16］认为全纤维环损伤模型可作为研究椎间盘再生和治疗(如生长因子)的较好选择。浅表纤维环损伤模型诱导椎间盘退变的速度较慢，但其包含了椎间盘自然退变的过程。melrose等［17］认为浅表纤维环损伤模型适用于研究椎间盘退变的病理生理过程。在兔椎间盘损伤模型中，兔椎间盘纤维环在针刺伤后2～8周内就出现修复和退变的改变，这些改变可通过放射学检查量化记录，其退变原因可能与纤维环损伤后椎间盘内脊索细胞、髓核细胞等发生组织学改变有关。羊椎间盘损伤模型的建模时间较兔椎间盘损伤模型明显延长，前者终板微血管的改变、小关节的骨关节炎和椎间盘细胞的代谢病理变化在损伤后6～9个月才变得明显。
2.3 酶化学模型
有学者提出对椎间盘进行蛋白酶消化或去除其糖胺聚糖(gag)多肽链，如注射木瓜凝乳蛋白酶或硫酸软骨素裂解酶，这可能是一种有效模仿椎间盘退变的方法。lotz［18］在直视下向椎间盘髓核内注射1 mg木瓜凝乳蛋白酶，注射后3周x线片显示椎间隙变窄，mri显示t2加权像信号强度降低，提示椎间盘退变。虽然蛋白酶注射法可导致椎间盘基质中蛋聚糖丢失，但在生理状态下哺乳动物的椎间盘细胞不能产生木瓜凝乳蛋白酶或硫酸软骨素裂解酶，且酶化学模型不能完全模拟退变椎间盘中蛋白聚糖丢失的典型改变，故此方法并不能很好的模拟椎间盘的生理退变。大剂量木瓜凝乳蛋白酶的蛋白水解活性会对椎间盘造成大面积破坏，只有使用最佳剂量才能产生理想的效果，单次最佳剂量还未确定。还有学者采用直接浸泡法建模。roberts等［19］将牛尾椎间盘置于含不同浓度的蛋白水解酶-胰岛素-木瓜蛋白酶混合物的培养基中培养3周，以构建退变模型，结果发现处理组与对照组相比，前者椎间盘中央区易染性丢失、糖胺聚糖含量下降，认为该模型对治疗椎间盘退变新方法的研究具有一定意义。
2.4 缺血模型
营养障碍被视为椎间盘退变的原因之一，但在正常椎间盘内尚未发现。hutton等［20］进行犬椎间盘缺血模型的研究，向实验组椎间盘单侧或双侧终板处注射骨水泥诱导血供障碍，注射后70周实验组椎间盘与对照组相比，未见明显的退变性改变，未记录这种干预方法所致营养物质运输的抑制量。krebs等［21］进行羊模型试验来观察多节段椎体成形术对椎间盘的影响，术后12个月发现与早期椎间盘退变相关的组织学修复改变，此实验也未评估有椎体成形术所引起的营养物质运输的改变。werf等［22］建立羊椎间盘营养障碍诱导椎间盘退变模型。切断终板血供并植入钛制薄片以阻止血管再生，证实此种干预措施可严重影响终板的血流灌注，并与对照组相比后抑制因子一氧化氮(n2o)与此种改变相关；还观察了此种干预措施的力学影响，发现髓核在生理上承受的轴向负荷并未改变。虽然缺血性干预措施的长期作用还有待观察，但它提示了营养障碍在椎间盘退变中起作用的重要信息。此外，缺血模型对于评估新的椎间盘退变和修复的生物学干预措施也有重要意义。
2.5 基因敲除模型
基因敲除模型较适于研究退变椎间盘内特定的蛋白突变，比如单倍体蛋白聚糖低表达的小鼠颈椎间盘退变模型。sahlman等［23］研究col2a1基因(编码ⅱ型胶原)在小鼠生长发育和椎间盘退变中的作用，结果显示col2al基因敲除组小鼠的四肢、头部和脊柱骨骼较正常小鼠短小，终板不规则增厚，纤维环、终板和椎骨内糖胺聚糖含量较正常小鼠少，并出现与人类相似的椎间盘退行性改变。基因敲除模型在椎间盘退变研究方面是否能广泛应用，还有待证明。
2.6 吸烟模型
oda等［24］进行鼠被动吸烟模型的研究，制作了被动吸烟装置，并将8周龄鼠置于其中被动吸烟，8周后检测鼠血中尼古丁水平并观察鼠椎间盘细胞，发现吸烟可使细胞炎性因子分泌增加和细胞分解活动增强，提示吸烟可能与椎间盘退变相关。nemoto等［25］的鼠吸烟模型研究也提示吸烟可能与椎间盘退变有关。
3 结语
椎间盘退变的实验动物模型是一项长期的探索性工作，它是研究椎间盘退变发生机制和治疗的基础。目前国内外报道的动物体内、体外模型各有应用局限，尚无公认的完全模拟人椎间盘退变的标准模型。研究椎间盘退变及修复的动物模型关键在于确立动物椎间盘退变模型和人椎间盘退变之间的相关性和可比性。随着近年来对各种动物椎间盘退变模型研究的进展，对椎间盘退变生物学机制的研究也将更深入，对动物椎间盘退变模型的研究意义则更重大，任务更重。
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