β1整合素表达下调对人结肠癌细胞增殖和化疗敏感性影响
【关键词】 结肠肿瘤;抗原,cd29;细胞增殖;药物筛选试验,抗肿瘤
【摘要】 目的观察β1整合素表达下调对人结肠癌ht-29细胞增殖和化疗敏感性的影响。方法采用反义寡核苷酸(asodn)技术转染ht-29细胞，逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)检测β1整合素表达下调情况。mtt法检测ht-29细胞相对存活率。给予梯度浓度氟尿嘧啶(5-fu)，计算ic50。结果实验组β1整合素条带吸光度积分(iad)值/β-actin条带iad值的比值及ht-29细胞的存活率与对照组相比显著降低(f=1 630.08,q=72.40,p<0.01;t=4.37,p<0.05)。5-fu+asodn组ht-29细胞对5-fu的ic50与5-fu组比较显著下降(t′=37.71,p<0.05)。结论β1整合素表达下调可抑制结肠癌细胞增殖，增强结肠癌细胞对化疗药物敏感性。
【关键词】 结肠肿瘤;抗原,cd29;细胞增殖;药物筛选试验,抗肿瘤
[abstract]objectiveto investigate the effect of down-regulation of integrin-β1 expression on cell proliferation and chemosensitivity of human colon cancer cell line ht-29.methodsht-29 cells were transfected with antisense oligonucleotide technology, the down-regulation of integrin-β1 mrna expression was detected by rt-pcr. the relative survival rate of ht-29 cells was determined by mtt method. gradient concentrations of 5-fluorouracil (5-fu) were given, and ic50 calculated.resultsin comparison with the control group, the expression of integrin-β1 mrna of ht-29 cells in the experimental group was markedly down-regulated (f=1 630.08,q=72.40,p<0.01), and the survival rate of ht-29 cells was significantly reduced (t=4.37,p<0.05), and the ic50 remarkably decreased (t′=37.71,p<0.05).conclusiondown-regulation of integrin-β1 can effectively inhibit cell proliferation and enhance the sensitivity of human colon cancer cell to chemotherapeutics.
[key words]colonic neoplasms; antigens, cd29; cell proliferation; drug screening assays, antitumor
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年增高。WWw.11665.com肝转移是影响结直肠癌预后的重要因素，无法切除肝转移灶病人的中位生存期仅6.9个月[1]。目前，手术仍是惟一有效的治愈手段，但仅有10%病人适合于手术切除。现有的化疗药物大多疗效欠佳，因此降低药物副作用、增强化疗敏感性已成为目前结肠癌治疗的研究热点。整合素主要介导细胞与细胞外基质(ecm)的黏附，是一类最重要的细胞黏附分子。整合素还介导细胞间的黏附，参与细胞多种生理功能和病理变化。谭晓杰等[2]研究显示，β1整合素反义寡核苷酸(asodn)通过降低β1整合素表达，对人结肠癌ht-29细胞体外侵袭具有抑制作用。本实验采用asodn技术使人结肠癌ht-29细胞β1整合素表达下调，观察β1整合素表达下调对ht-29细胞增殖和对化疗药物敏感性的影响。
1资料与方法
1.1细胞培养
人结肠癌细胞株ht-29购于武汉同济医院。将细胞接种于含体积分数0.10小牛血清的rpmi 1640培养液(gibco公司)中，在37 ℃、95%湿度及体积分数0.05 co2的培养箱中培养，每48 h胰酶消化传代1次，实验所用细胞均处于对数生长期。
1.2asodn技术
β1整合素asodn序列为:5′-t*g*cagtaagcatccat*g*t-3′，无义寡核苷酸(nsodn)序列为：5′-g*c*aacgagagagccgt*c*g-3′,*为硫代位点，由大连宝生物公司合成。实验分3组：实验组(以脂质体转染asodn)、nsodn组(以脂质体转染nsodn)和对照组(未转染)。在聚苯乙烯管中以无血清rpmi 1640培养液分别稀释asodn、nsodn和lipofectamine 2000脂质体，asodn及nsodn浓度均为120 mg/l，lipofectamine 2000脂质体终浓度为10 mg/l。分别将两管稀释液轻轻混匀以便形成寡核苷酸-脂质体复合物，于室温下放置40 min。取对数生长期的ht-29细胞，使用无血清的rpmi 1640培养液洗1次，然后缓慢加入寡核苷酸-脂质体复合物，置于37 ℃、95%湿度及体积分数0.05 co2的培养箱中培养6 h，弃去转染液，换含体积分数0.20胎牛血清的rpmi 1640培养液继续培养48 h。
1.3rt-pcr检测β1整合素mrna的表达
采用trizol总rna纯化试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取总rna，用逆转录酶和oligo(dt)按37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min条件进行cdna 的合成。取1 μl逆转录产物进行pcr扩增，反应条件为：95 ℃变性5 min，95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，32个循环，72 ℃延伸10 min。反应体系以β-actin作为内参照。β1整合素上游引物：5′-aa- tgaagggcgtgttggtag-3′;下游引物：5′-ct-gccagtgtagttggggtt-3′，扩增产物长290 bp。β-actin上游引物：5′-gggacctgactgactacc-tc-3′;下游引物：5′-actcgtcatactcctgcttgctg-3′，扩增产物长546 bp，上述引物均由大连宝生物公司合成。
1.4mtt法检测细胞存活率
单细胞悬液以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100 μl。培养24 h后，以无血清rpmi 1640培养液洗1次，缓慢加入寡核苷酸和脂质体复合物，在37 ℃、95%湿度及体积分数0.05 co2 的培养箱中培养6 h，弃去转染液，换含体积分数0.10小牛血清的rpmi 1640培养液继续培养。于转染后72 h用mtt法在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(a)值，计算细胞存活率。细胞存活率=实验孔a值/对照孔a值×100%。实验重复4次，取其均值。
1.5β1整合素表达下调对化疗敏感性的影响
ht-29细胞接种于96孔板，按处理方法分为氟尿嘧啶(5-fu)组和5-fu+asodn组。转染24 h后两组细胞均加入梯度浓度的5-fu(25、50、100、200 mg/l)，继续培养48 h。以prism 3软件计算化疗药物的ic50。
1.6统计学分析
采用spss 11.5软件进行t检验和方差分析。
2结果
2.1ht-29细胞β1整合素mrna的表达
如图1所示，实验组β1整合素条带吸光度积分(iad)值/β-actin条带iad值的比值(0.221±0.011)与对照组(0.954±0.025)比较，差异有统计学意义(f=1 630.08，q=72.40，p<0.01);而nsodn组(0.901±0.022)与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。
2.2β1整合素表达下调对ht-29细胞存活率影响
对照组ht-29细胞存活率为100%，nsodn组为(92.90±4.32)%，两组比较差异无显著性(p>0.05);实验组ht-29细胞的存活率为(61.10±1.78)%，较以照组显著降低(t=4.37，p<0.05)。
2.3β1整合素表达下调对ht-29细胞化疗敏感性的影响
5-fu+asodn组ht-29细胞对5-fu的ic50为(31.45±0.79)mg/l，低于5-fu组的(126.53±4.98) mg/l，差异有显著性(t′=37.71，p<0.05)。a：marker dl2000;b：对照组;c：nsodn组;d：实验组。图1人结肠癌ht-29细胞β1整合素mrna的表达
3讨论
整合素是由α和β两个亚基组成的异二聚体，β亚基的胞浆区含有asp-x-sev-x-sev 序列，参与细胞骨架蛋白的相互作用和胞内信号传导。整合素将胞外的ecm 分子与细胞内的骨架蛋白连接起来形成焦点黏附物。焦点黏附物是整合素内外双向信号传导的结构基础，许多信号蛋白通过与焦点黏附物结合，调节细胞凋亡、增殖、迁移和黏附[3]。整合素与肿瘤细胞的凋亡及耐药具有密切关系。johnstone 等[4]认为，肿瘤细胞产生耐药的关键因素之一是肿瘤细胞凋亡机制缺陷。fornaro等[5]研究结果显示，β1整合素与ecm配体结合后，通过pkb/akt途径使survivin的表达上调，对肿瘤坏死因子-α诱导的前列腺癌细胞凋亡具有抑制作用。matter等[6]研究显示，αvβ3、α5β1整合素与ecm中的相应配体(玻璃黏连蛋白、纤连蛋白)结合后可激活fak和shc，通过黏着斑蛋白激酶(kak)依赖的ras信号系统激活pi-3k/akt，从而提高bcl-2的转录水平，使细胞的凋亡受到抑制。aoudjit等[7]研究显示，在mda-mb-231 和 mda-mb-435乳癌细胞中，β1整合素与ecm配体结合，通过激活pi-3k/akt信号传导通路，抑制线粒体释放细胞色素c，对抗紫杉醇和长春新碱等化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡。以上研究结果提示，调控整合素的表达可能诱导肿瘤细胞凋亡和逆转耐药的发生。
asodn技术[8]是将与靶基因序列互补的小分子寡核苷酸导入细胞，通过激活核酶rnaseh等机制，促使mrna降解，抑制转录过程，从而抑制编码蛋白的表达。
本实验采用asodn技术使人结肠癌ht-29细胞β1整合素表达下调，其结果显示实验组ht-29细胞存活率显著降低(p<0.05)，而nsodn对ht-29细胞生长无明显影响。提示下调β1整合素表达具有抑制ht-29细胞增殖的作用。然而，肿瘤的发生发展是一个多基因变异累积的过程，单一下调某种靶基因不可能有效地抑制肿瘤进展。多项研究证明，asodn与化疗药物联合应用可产生更强的抗肿瘤效应[9]。
本实验采用asodn技术使人结肠癌ht-29细胞β1整合素表达下调，加入梯度浓度的化疗药物5-fu，研究结果显示5-fu+asodn组的ht-29细胞对5-fu的ic50明显低于5-fu组。β1整合素表达下调，可能通过诱导凋亡抑制ht-29细胞的生长，同时增强了ht-29细胞对化疗药5-fu的敏感性，其具体的机制有待进一步探讨。
本研究结果提示，β1整合素表达下调能明显抑制ht-29细胞的增殖，联合应用化疗药物，可降低化疗药剂量，减少其副作用，并增强癌细胞对化疗的敏感性。
【参考文献】
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