作者：郑金旭， 张小燕， 端礼荣， 陈炜， 管淑红
【摘要】 目的： 观察重组人转化生长因子β1(rhtgfβ1)对人肺上皮细胞株(a549)的转化作用。方法： 将体外培养的a549用不同浓度的rhtgfβ1干预后，倒置显微镜观察细胞形态学的变化，用mtt法检测rhtgfβ1对a549增殖的影响。48 h收集蛋白用蛋白质印迹和间接免疫化学方法检测间充质细胞表型fibronectineda（fneda）表达变化。结果： rhtgfβ1诱导a549向间充质细胞形态转化，在体外对a549增殖无明显影响，上调间充质细胞表型fneda 表达。结论： rhtgfβ1可诱导a549发生上皮细胞-间质转化(ephethlialmesenchymal transition,emt)，支持肺上皮细胞发生emt的观点。
【关键词】 转化生长因子β1； 人肺上皮细胞株(a549)； 上皮细胞-间质转化
［abstract］ objective: this experiment was designed to investigate the differentiatied role of the recombinal human tranfoming growth factor beta1(rhtgfβ1) on one strain of human alveolar epithelial cells.methods： cultured a549 cells were treated at different concentration, the morphology change observed under phasecontrast microscopy; the effect of proliferation of a549 were detected by mtt. the fibronectineda expession were analysised of cell lysates by western blotting after 48 h and inderict eneyme inmmuohistorchemitery(iei). results： the data showed that rhtgfβ1 induced a549 cells morphological alteration from alveolar epithelial to mesenchymal， ineffected with a549 cells proliferation， upregulation of the mesenchymal phenotype fibronectineda marker. conclusion： our study showed that tgfβ1 induced a549 cells with an alveolar epithelial cell phenotype differentiation in vitro, supporting the concept of ephethlialmesenchymal transition(emt).
［key words］ tranfoming growth factor beta1; human alveolar epithelial cells lines(a549); ephethlialmesenchymal transition
特发性肺纤维化(ipf)是一种病因不明的常见致命性间质性肺病，病理改变表现为间质炎症、纤维化和蜂窝肺改变，与正常肺组织呈灶状交替出现［1］。WWW.11665.cOM近年来发病率有明显增高的趋势，临床缺乏有效的治疗手段。
随着对ipf发病机制的深入研究，发现肺纤维化病灶内增生的肌成纤维细胞(mfb) 除来源于肺内固有的间充质细胞外,纤维化病灶内肺泡ⅱ型上皮细胞可能通过上皮细胞-间质转化(ephethlialmesenchymal transition,emt) 而成为mfb 的另一主要来源，而tgfβ1在emt过程中发挥关键作用［2］。emt是指上皮细胞失去其特有的表型，获得新的表型，转化为间质细胞的过程。其特点是上皮细胞发生了形态和表型改变，产生胶原，导致器官的纤维化。
a549具有ⅱ型肺泡上皮的重要特征［3］，我们以a549细胞为研究对象，观察tgfβ1对a549细胞形态学变化和增殖作用，以及对其间充质标志物fneda蛋白表达的影响，进一步探讨ipf发病过程中肺上皮细胞发生emt的可能过程。
1 材料和方法
1.1 材 料
细胞：a549细胞(购自中国科学院细胞库)。rhtgfβ1（购自r&d公司），小鼠抗人fneda 单克隆抗体（购自abcam公司），fitc标志的羊抗小鼠igg、辣根酶标记羊抗小鼠igg(均购自武汉博士德生物工程有限公司）,mtt(购自南京大冶生物科技有限公司)。
1.2 方 法
1.2.1 细胞培养［4］ a549用含10%胎牛血清，100 u/ml 青霉素，100 μg/ml庆大霉素,低糖-dmem培养基，常规培养于5%的co2,37℃ 人工培养箱中,培养至细胞融合70%～80%，用无血清培养基饥饿24 h，随机把细胞分组，在无血清培养基中加入rhtgfβ1，按实验要求分组。
1.2.2 细胞形态学观察 将a549细胞1×105传代于50 ml培养瓶中,换无血清培养基培养过夜,加入不同浓度的tgfβ1（1, 5,10 ng/ml）培养48 h, 相差显微镜下观察细胞形态的变化并拍照。
1.2.3 mtt比色法 用0.25%胰酶消化细胞配成细胞悬液，以每孔1 000～5 000细胞数接种于96孔板，每孔体积200 μl，培养细胞24 h,换成无血清培养基饥饿过夜，加入不同浓度的rhtgfβ1（1.0, 5.0,10.0 ng/ml ），并设空白对照组，分别培养24,48 h后，每孔加入mtt 20 μl, 37℃,继续孵育4 h,终止培养，吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μl dmso,振荡10 min,使结晶物充分溶解。以空白孔调零，酶联免疫检测分析仪上测定490 nm波长处的d值。以上实验重复3次。
1.2.4 蛋白质印迹 不同tgfβ1浓度(1.0, 5.0,10.0 ng/ml)干预细胞48 h后，培养瓶中的贴壁细胞用4 ℃的pbs洗涤后转移到ep管，12 000 r/min离心5 min，弃去上清，将收集到的细胞加细胞裂解液裂解后，取上清-20℃储存。上样，80 v电泳积聚蛋白，120 v电压使蛋白分离。转膜，4 ℃ 12 h，5%脱脂牛奶封闭1 h。在室温下小鼠抗人fneda单克隆抗体(1∶400)与膜接触孵育1 h后，用tbst在脱色摇床下洗膜10 min×3次，加辣根酶标记羊抗小鼠igg，室温下孵育1 h后，用tbst洗膜10 min×3次，加入ecl化学发光显示剂在室温下反应5 min后，taiphone扫描结果,gene snap/gene tool软件分析蛋白条带。
1.2.5 间接免疫荧光方法 以每孔1×104个细胞接种于24孔培养板中预置的载玻片上，细胞贴壁爬片，用无血清培养基饥饿24 h，加入5.0 ng/ml的tgfβ1,设空白对照组，48 h后，取出载玻片，用0.4%低聚甲醛固定60 min，加小鼠抗人fneda单克隆抗体(1∶200)4℃过夜，加fitc标志的羊抗小鼠igg(1∶50),37℃下1 h，缓冲甘油封固，荧光显微镜下观察并拍片。
1.2.6 统计学分析 数据采用spss11.5统计学软件进行处理，所有的数据均以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，p<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 tgfβ1对a549形态变化观察
在tgfβ1刺激下，通过相差显微镜下我们观察到，a549细胞形态发生了明显的变化。a549细胞通常保持为鹅卵石状上皮形态及相应的生长模式，在5 ng/ml tgfβ1诱导后，细胞形态表现为类似成纤维细胞，细胞和细胞之间的连接变得松散。见图1。
2.2 tgfβ1对a549增殖的影响
a549在低糖-dmem培养基中生长良好，随着时间的延长，细胞数量增加。加tgfβ1培养24 h,48 h后，与对照组相比，细胞增殖无统计学意义（p>0.05）。
2.3 tgfβ1对a549细胞fneda蛋白表达的影响
随着tgfβ1浓度增加，fneda蛋白表达上调（图2）。各组相对灰度值分别为：对照组0.121±0.019,1 ng/ml组为0.218±0.079,5 ng/ml组为0.419±0.027,10 ng/ml为0.450±0.035，各浓度组与对照组相比均有统计学意义（p<0.01），5 ng/ml与1 ng/ml组相比，fneda蛋白表达明显增高（p<0.01），但10 ng/ml 组与5 ng/ml组相比无统计学意义（p>0.05），提示5 ng/ml tgfβ1为上调fneda蛋白表达最佳浓度。荧光显微镜下观察，正常上皮细胞未见明显的fneda表达(图3)，在5 ng/ml tgfβ1刺激下，细胞外形伸长，并与周围细胞分离，细胞表达fneda，胞膜可见耀眼的荧光染色（图4）。
1为对照组, 2～4分别表示tgfβ1浓度为1.0 ng/ml， 5.0 ng/ml,10.0 ng/ml
图2 fneda蛋白质印迹结果（略）
fig 2 results of the expression of fneda by western blotting
3 讨论
特发性肺纤维化患者肺实质纤维灶内间充质细胞主要包括成纤维细胞和肌纤维母细胞，这些细胞大量增生，伴随细胞外基质的沉积。然而，对于纤维灶具体形成机制和其细胞来源目前仍不清楚。目前认为先有肺泡上皮细胞的损伤而后出现纤维灶，因此，推测肺泡上皮细胞除了通过自身的损伤与修复反应以外，由诱导或促进损伤的肺泡上皮细胞通过emt过程发生转化亦起重要作用。发生emt转化的细胞可促进纤维灶的发展和增生，并产生大量的细胞外基质。tgfβ1是肺纤维化的关键性细胞因子，是成纤维细胞的化学吸引剂,它可刺激未成熟成纤维细胞生长,并促使组织的成纤维细胞聚集、扩散和分化。tgfβ1可诱导和促进胶原蛋白产生和沉积,通过自分泌或旁分泌作用,协调与其他细胞因子的作用,促进细胞增殖和细胞外基质沉积。fneda是一种膜蛋白，分布于细胞表面，是间充质细胞的重要成分之一，在电镜下可见细胞表面形成纤细的网状结构，提供了细胞附着的基质，可促使成纤维细胞增殖和活化［5］。
我们的研究发现，以外源性的tgfβ1刺激体外培养的ⅱ型肺泡上皮系a549，细胞形态学发生很明显的变化。正常肺上皮细胞为鹅卵石状，用tgfβ1刺激后，细胞外形变长，与周围细胞连接松散，呈现间充质细胞样形态。同时间充质标志物fneda表达明显上调，并随tgfβ1浓度增加表达增强。推测肺泡上皮细胞在损伤修复的过程中tgfβ1促使其转化为间充质细胞，发生emt。转化后的肺上皮细胞fneda表达上调，刺激成纤维细胞增生和激活。研究认为在肺上皮受损的同时，肺泡结构发生变化，增加了各种致纤维化因素与肺泡巨噬细胞、成纤维细胞的接触，进而活化肺内间质细胞，促进间质内炎症，启动肺纤维化的发生和发展［6］。
tgfβ1刺激肺上皮细胞发生转化的机制可能与smad信号转导途径有关［7］，但目前对这方面研究还很有限，因此，有待进一步研究来阐明肺纤维化发生机制，为临床治疗提供有效的思路和策略。
【参考文献】
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［4］ 司徒镇强,吴君正.细胞培养［m］.4版.西安：世界图书出版公司西安分公司，2004：186-198.
［5］ 罗发兴,翁利荣,何小维.纤维结合蛋白(fn)的结构及其分离纯化［j］.食品研究与开发,2006,27(3):59-60.
［6］ 赵 勇,曾庆富. 肺泡ⅱ型上皮细胞与肺纤维化［j］. 国外医学：生理、病理科学与临床分册, 1998,18(4):355-357.
［7］ kasai h, allen jt, mason rm, et al.tgfβ1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition(emt) ［j］. respiratory research,2005,9(6) :56-58.
