二苯乙烯苷对糖尿病大鼠肾脏沉默信息调节因子2同源体和 tgfβ1蛋白的影响
【关键词】 糖尿病;系膜细胞;二苯乙烯苷;沉默信息调节因子2同源体;转化生长因子β1
【摘要】 目的 探讨二苯乙烯苷(tsg)对糖尿病大鼠肾脏沉默信息调节因子2(sirt1)和 转化生长因子β1(tgfβ1)蛋白的影响。方法 以链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型和高糖刺激大鼠肾系膜细胞株为研究对象，全自动生化分析仪测定生化指标，比色法检测细胞培养液中的超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽(gsh)的活性、丙二醛(mda)含量的变化，四甲基偶氮唑蓝(mtt)测定肾小球系膜细胞(gmcs)增殖活性，western印迹检测大鼠肾脏和系膜细胞中sirt1和 tgfβ1蛋白表达。结果 糖尿病肾病(dn)组大鼠的24 h尿蛋白定量、肾脏肥大指数、三酰甘油(tg)、总胆固醇(tc)、血尿素氮(bun)、血肌酐(cr)与对照组比较明显增加(p<0.01)，而tsg能明显改善上述指标，并改善大鼠抗氧化应激能力。tsg能明显增加糖尿病大鼠肾脏和高糖环境下系膜细胞sirt1蛋白表达，并抑制tgfβ1蛋白表达。结论 tsg对dn具有保护作用，其作用机制可能通过提高机体抗氧化应激能力，调节sirt1活性，并抑制肾脏tgfβ1蛋白表达而减少dn损害。
【关键词】 糖尿病;系膜细胞;二苯乙烯苷;沉默信息调节因子2同源体;转化生长因子β1
【abstract】 objective to observe the influence of tetrahydroxystilbene glucoside (tsg)on silent mating type information regulation 2 homolog 1 (sirt1) and transforming growth factorβ1 (tgfβ1) in kidney of rat with diabetes. methods diabetes mellitus model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin (60 g/kg). the serum biochemical parameters in rats were measured by automatic chemistry analyzer. the activity of superoxide dismutase (sod) and the levels of malondialdehyde (mda), glutathione (gsh) in renal tissue were assayed. the proliferation activity of mesangial cells was assessed by mtt assay, the expression of sirt1 and tgfβ1 protein examined by western blot. results 24 hours urinary albumin excretion (uae), kidney hypertrophy index, cholesterol (tc), triacylglyceride (tg), serum urea nitrogen (bun), serum creatinine in diabetic rats were increased compared with control group. tsg could improve above changes and the ability of antioxidation. tsg could increase the expression of sirt1 in kidney of diabetic rat and mesangial cells cultured in high glucose and inhibit the expression of tgfβ1. conclusions the protective mechanisms of tsg against dn are involved in the alleviation of oxidative stress injury and the depression of tgfβ1, partially via the activation of sirt1.
【key words】 diabetes; mesangial cell; tetrahydroxystilbene glucoside; silent mating type information regulation 2 homolog 1; transforming growth factorβ1
糖尿病肾病(dn)的发病机制与高血糖作为启动因子而诱导产生的多种血管活性物质、生长因子、细胞介质以及肾脏血流动力学改变等因素的综合作用有关〔1〕。Www.11665.CoM上述因素均可引起肾脏细胞内信号转导通路发生改变，其中转化生长因子(tgf)β1蛋白的激活在dn的发生发展中起核心作用〔2〕。沉默信息调节因子2同源体(sirt1)是防治糖尿病及相关性疾病的重要靶点之一，激活sirt1对2型糖尿病有防治作用， 并认为sirt1的小分子激活剂可用于防治dn〔3，4〕。二苯乙烯苷(tsg)是传统中药蓼科植物何首乌中提取的一种水溶性有效成分，具有抗炎、抗衰老、降血脂、心血管活性和免疫调节等功能〔5〕。本实验采用糖尿病大鼠模型和高糖环境下培养的大鼠肾小球系膜细胞(gmcs)，观察tsg干预后对糖尿病大鼠sirt1和 tgfβ1蛋白影响，初步探索tsg对dn的保护作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
大鼠肾系膜细胞株hbzy1(中国典型动物保藏中心)，tsg(北京中国药品生物制品鉴定所，纯度98%，批号z0809123)，链脲佐菌素(stz;sigma公司)，dmem培养液(gibco，usa)，新生胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)，胰蛋白酶(sigma,usa)，n2羟基乙烷基哌嗪n2乙烷磺酸(hepes，sigma，usa)，超氧化化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)及谷胱甘肽过氧化物酶(gshpx)试剂盒(南京建成);sirt1、tgfβ、βactin抗体(santa cruz，usa)。细胞培养箱(美国thermo forma);血糖测定仪(美国，罗氏);酶标仪(biotek fl800美国产品);细胞分析仪/casy细胞计数仪(德国casy公司产品);spectrafluor plus光度仪(tecan公司)。
1.2 动物模型建立和分组
大鼠糖尿病模型的建立和分组：清洁级近交系雄性sd大鼠(由湖北省医学科学院实验动物中心提供)，体重(220±14) g，每笼5只，饲养于标准环境，12 h光照周期。适应性喂养1 w后，单次腹腔注射用柠檬酸缓冲液(0.1 mol/l;ph4.5)新鲜配制stz 60 mg/kg。3 d后空腹血糖≥16.7 mmol/l为糖尿病，成模后，将大鼠随机分成dn模型组、tsg干预组ⅰ和ⅱ各10只。tsg干预组于造模成功后1 w给予tsg腹腔注射，剂量分别为10和20 mg/kg。对照组大鼠10只，腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液，所有动物8 w处死。
1.3 大鼠肾系膜细胞培养和分组
培养于含10%胎牛血清的dmem中，常规置于37℃，5% co2培养箱中孵育，用0.25%胰蛋白酶消化传代，每周传代2～3次。分组：正常对照组(ng，葡萄糖5.5 mmol/l)，高糖组(hg，葡萄糖30 mmol/l)，hg+tsg(1、5、25、100 μmol/l)组，甘露醇组(5.5 mmol/l葡萄糖+24.5 mmol/l甘露醇)。
1.4 生化指标和抗氧化指标测定
血清总胆固醇(tc)、三酰甘油(tg)、血肌酐(cr)、尿素氮(bun)采用beckman全自动生化分析仪测定，血糖采用血糖测定仪，考马斯亮蓝法测定24 h尿蛋白排泄量检测。肾组织中sod、mda及gshpx，操作按试剂盒(南京建成)说明书进行。
1.5 mtt法检测gmcs增殖活性
取对数期大鼠gmcs，每孔2～4×104细胞接种于96孔板上，12 h待细胞亚融合后改0.5%的胎牛血清dmem培养24 h使细胞同步化。弃上清，按上述方法分组给药，每组设6个复孔，处理48 h，于实验终止前4 h每孔加10 μl(5 mg/ml)mtt。4 h后用吸净上清液，加入100 μl dmso，振荡10 min于酶标仪上570 nm波长处测od值。tsg共孵育组在实验前均用台盼蓝染色，活细胞均大约90%，排除了tsg的细胞毒作用。
1.6 western印迹检测
取对数期gmcs接种于50 ml培养瓶，12 h后改用0.5%血清的dmem培养液培养24 h使细胞同步化。按上述分组给药，作用48 h后，细胞裂解液提取细胞蛋白，蛋白含量用改良lowry法测定。取总蛋白75 μg经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜，用丽春红染色观察转移效果并标出相对分子量标准。然后用5%脱脂奶粉的tbst室温封闭1 h。洗膜后加入一抗(santa cruz公司，1∶500稀释)4℃过夜。再用辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠多抗(1∶500稀释)杂交1 h;洗膜后加增强化学发光(ecl)，然后将硝酸纤维膜放入x光片暗盒，压片，显影，定影。
1.7 统计学处理
采用spss11.0统计软件分析，数据以x±s表示，多组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 tsg对dn大鼠血糖、tc、tg、肾功能、24 h尿蛋白排泄量、肾重/体重的影响
dn组大鼠明显多饮，多食，多尿，生长减慢，体重减轻，tc、tg、cr、bun、24 h尿蛋白排泄量(uae/24 h)升高(p<0.01)。tsg干预后能缓解上述生化指标的改变，与dn组比较有统计学差异(p<0.05)，以大剂量tsg干预效果更明显。tsg干预组血糖(bg)值与dn组比较有所下降，但无统计学差异(p>0.05)。dn组大鼠肾重/体重(kw/bw)明显升高，与正常对照组比较有统计学差异(p<0.05)，tsg干预后kw/bw比值出现下降趋势，与dn组比较有统计学差异(p<0.05，p<0.01)。见表1。表1 tsg对糖尿病肾病大鼠血糖、三酰甘油、总血尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白排泄量和肾重/体重的影响
2.2 tsg对糖尿大鼠肾脏氧化应激指标的影响
8 w时dn组大鼠sod活性、gshpx活性均下降、mda含量升高(p<0.01);小剂量tsg干预可使sod，gshpx活性升高(p<0.05)， 大剂量tsg干预使上述指标进一步改善外，还可见mda含量显著下降(p<0.05)。见表2。表2 tsg对糖尿大鼠肾脏氧化应激指标的影响
2.3 tsg对糖尿大鼠肾脏tgfβ1和sirt1蛋白表达的影响
dn组大鼠肾皮质tgfβ1蛋白表达明显增加，与正常对照组比较有统计学差异(p<0.05)，tsg干预后tgfβ1蛋白表达量明显下降。而dn组大鼠肾皮质sirt1蛋白表达明显下降，tsg干预能缓解sirt1蛋白表达下调，以tsg大剂量干预组效果明显。见图1。图1 tsg对大鼠肾脏tgfβ1、sirt1蛋白的影响图2 tsg对高糖环境下系膜细胞tgfβ1、sirt1表达的影响
2.4 tsg对高糖环境下系膜细胞增殖的影响
高糖环境对系膜细胞在培养48 h时有刺激系膜细胞增殖的效应(164.5±15.4)，1，5，25，100 μmol/l的tsg均能抑制高糖诱导的细胞增生(156.8±13.4，147.6±12.7，129.7±12.9，111.9±13.1)(p<0.05)，且随着剂量的增加，其抑制作用增强(p<0.05，p<0.01)，呈剂量依赖性关系。
2.5 tsg对高糖刺激的系膜细胞sirt1和tgfβ1蛋白表达的影响
体外培养肾小球系膜细胞，发现高糖能诱导系膜细胞tgfβ1蛋白表达上调，sirt1蛋白表达下降，甘露醇组sirt1和tgfβ1蛋白变化不明显，说明高糖激活sirt1和tgfβ1蛋白变化与高渗无关，而高剂量tsg预处理后能逆转高糖引起的sirt1和tgfβ1蛋白变化。见图2。
3 讨 论
何首乌被人们认为是延年益寿、延缓衰老之功效，系著名的滋补中药。现代医学表明，何首乌具有多种生物学功效〔5〕。tsg是何首乌中提取的一种具有显著药理活性水溶性有效成分，与sirt1激活剂resveratrol具有相似的化学结构，而resveratrol可通过调节氧化性损伤纠正dn大鼠肾功能紊乱〔6〕。目前研究表明活性氧(ros)在dn发生发展中起着信号转导作用，可通过激活tgfβ1、血管紧张素ⅱ、蛋白激酶c和丝裂原激活蛋白激酶等作用而参与dn发生和发展〔7〕。肾组织过氧化产物堆积、内在抗氧化酶活性降低在糖尿病的发生发展中起着重要作用。本结果显示tsg对糖尿病大鼠肾脏具有明显的抗氧化作用，并呈剂量依赖的方式。同时tsg可调节糖尿病大鼠脂质代谢紊乱，降低尿蛋白排泄率，缓解dn损害。
sirt1是一种具有nad2依赖的蛋白去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子， 在体内参与调控哺乳动物细胞寿命的不同信号通路及糖代谢，胰岛素分泌等多条代谢途径。sirt1 在哺乳动物组织中广泛表达，当热量限制或禁食时，在脑、脂肪、肾脏、肌肉以及肝脏中水平上调。目前认为sirt1是调控高糖环境下内皮细胞数量及功能的关键因子〔8〕，热量限制能够通过激活sirt1从而对2型糖尿病有防治作用，并认为sirt1是防治糖尿病及相关性疾病的重要靶点之一〔3，4〕。本研究以大鼠dn模型和高糖环境下培养的系膜细胞为对象，体内外探讨了tsg对dn的保护作用及机制，发现dn大鼠和高糖培养系膜细胞，均可抑制sirt1蛋白表达，而tsg预处理能逆转sirt1蛋白低表达。
dn损害是多种细胞因子和生长因子作用的结果，其中以tgfβ1为核心因子，是dn发病机制的最后共同通路〔7，9〕。目前认为tgfβ1可促使肾小球肥大和细胞为基质的堆积，并可通过多种途径损伤肾小球滤过屏障及促使肾间质纤维化。实验发现在dn大鼠模型和高糖刺激肾小球系膜细胞中tgfβ1均高表达，但是tsg可逆转这种现象。推测tsg对tgfβ1的调节作为可能与其激活sirt1蛋白和氧化应激有关，但具体的机制尚需进一步探讨。总之，通过以上研究将有利于拓宽对dn发病机制的认识，建立新的药物作用靶点，寻求新的有效制剂，为中医药防治dn提供理论和实验依据。
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