广西壮族腰椎间盘突出症血瘀证患者与tgf-β1 -509c/t基因多态性及部分危险因素的关联研究

【关键词】  腰椎间盘突出症　中医证型　 危险因素　tgf-β1 -509c/t基因多态性

【摘要】  ［目的］探讨腰椎间盘突出症血瘀证患者及部分危险因素与tgf-β1 -509c/t基因多态性的关联性。［方法］筛选符合既定相关标准的广西壮族人群腰椎间盘突出症患者88例,分为血瘀证组30例与非血瘀证组58例，进行tgf-β1 -509c/t基因多态性检测，并观测患者的腰椎负荷强度等指标，观察部分危险因素以及部分危险因素和tgf-β1 -509c/t基因多态性的交互作用与腰椎间盘突出症中医证型的关联性。［结果］经非条件logistic回归forward（lr）法分析显示广西壮族重度腰椎负荷强度者患腰椎间盘突出症血瘀证的风险是轻中度腰椎负荷强度者的3.911倍（95%ci:1.334～ 1.872）(p<0.05)，tgf－β1 基因-509c/t多态性与重度腰椎负荷强度的累积暴露发生腰椎间盘突出症血瘀证的风险是其中某单一因素的18.425倍（95%ci:1.767～ 3.693）(p<0.01)。［结论］重度腰椎负荷强度很可能是广西壮族人腰椎间盘突出症血瘀证的潜在危险因素之一，tgf－β1 基因-509位点ct基因型与重度腰椎负荷强度累积暴露更易发生血瘀型腰椎间盘突出症。Www.11665.coM

【关键词】  腰椎间盘突出症　中医证型　 危险因素　tgf-β1 -509c/t基因多态性

　　 association of transforming growth factor β1-509c/t site gene polymorphism and parts of the risk factors with blood stasis syndrome of lumbar intervertebral disc protrusion in zhuang ethnic population from guangxi zhuang autonomic region

　　xu jian-wen, zhong  yuan-ming, chen  jing, et al

　　department  of  orthopedics, the  first  affiliated  hospital  to guangxi  traditional  chinese  medicine  university, nanning  530023, china
   
　　abstract: ［objective］to investigate the relationship between the blood stasis syndrome and parts of the risk factors of lumbar intervertebral disk protrusion (lidp)and transforming growth factor β1 (tgf-β1) -509c/t site gene polymorphisms.  ［methods］a total of 88 zhuang ethnic patients from guangxi zhuang autonomous region were selected according to standard of lidp, 30 with blood stasis syndrome and the other 58 without , then, their single nucleotide polymorphism (snp) of tgf-β1 -509c/t and risk factors like lumbar burden intensity were tested, and their relationship with the traditional chinese medicine syndrome of lidp were analyzed.［results］it was showed by logistic regression  forward (lr) analysis that risk of syndrome of blood stasis pattern of lidp in patients with severe lumbar burden was  3.911 times （95%ci:1.334～1.872）of that in patients with mild and middle lumbar burden (p<0.05) , and the risk further increased 18.425 times（95%ci:1.767～ 3.693）after it's accumulating with tgf-β1 -509c/t site gene polymorphisms in zhuang ethinic group in guangxi(p<0.01).［conclusion］severe lumbar burden may be one of the risk factors of syndrome of blood stasis pattern of lidp in zhuang ethnic populational from guangxi. patients with tgf-β1 gene－509 adiponectin ct genotype and combined severe lumbar burden are susceptible to syndrome of blood stasis pattern of  lidp.
   
　　key  words：lumbar  intervertebral  disk  protrusion;  syndrome pattern of  traditional  chinese  medinine;  risk  factors;  transforming growth factor-β1 -509c/t gene  polymorphisms
   
　　腰椎间盘突出症（lumbar  intervertebral  disk  protrusion ,lidp) 是最常见的脊柱骨科疾病，中医辨证以血瘀证多见，国内外学者研究多年，但腰腿痛反复发作仍是目前很多医生和患者无法回避的问题。本文探讨tgf-β1 -509c/t(transforming  growth  factor  β1,转化生长因子β1)基因多态性及部分危险因素与lidp血瘀证的关联性，为进一步研究本病防治措施提供参考。

　　1  临床资料

　　1.1  一般资料

 　   随机抽取2007年1～12月在广西中医学院第一附属医院骨科临床确诊为腰椎间盘突出症并中医辨证为血瘀证的患者30例作为观察组，均为无血缘关系的中国广西地区壮族人，对照组选自同期在本院骨科就诊并年龄、性别、家族史等暴露背景与观察组相匹配的腰椎间盘突出症非血瘀证患者60例，最终纳入研究对象共88例，男49例，女39例，其中血瘀证组30例，非血瘀证组58例，两组患者年龄、性别及家族史等基本资料比较无显著性差异 (p> 0.05)，具有可比性。

　　1.2  病例诊断及中医辨证标准

 　   西医诊断标准参照胡有谷［1］主编的《腰椎间盘突出症》（2005.9）及胥少汀［2］主编的《实用骨科学》（2005.4）；中医辨证参照国家卫生部及中医药管理局相关行业标准［3、4］，中医辨证为血瘀证者归入血瘀证组，中医辩证为寒湿证、肝肾亏虚证及湿热证者归入非血瘀证组。

　　1.3  病例选择及纳入标准

   　 (1)确诊为腰椎间盘突出症的患者；(2)年龄19～58岁；(3)无可查亲缘关系、向上追溯三代均为壮族的个体；(4)临床资料完整；(5) 患者知情同意，自愿参加调查，无医学理论学争议。

　　1.4  病例排除标准

  　  (1)合并肝肾疾病、心脑血管、呼吸系统或精神病患者；(2)合并血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤等；(3)体质指数(body  mass  index,bmi) 小于18.5 kg/m2或大于28.0 kg/m2；(4)吸烟指数大于300支/d·y者；(5)临床资料不完整。

　　1.5  临床指标观测方法

　　1.5.1  吸烟指数（smoking index,si）：按平均每天吸烟数目乘以吸烟年限评价，参考battie等方法［5］划分为不吸烟和吸烟两个等级，不吸烟指从未吸过烟和si＜100的个体，吸烟指吸过烟而且si≥100的个体。具体计算方法为si＝支/ｄ×年。由三位经过培训的课题调查员通过问卷调查后提出分类意见。

　　1.5.2  体质指数(bmi)：采用国际通用方法，超重、肥胖判定标准根据国际生命科学会中国办事处中国肥胖问题工作组对中国成人体质指数分类的推荐意见中建议标准［6］，分为过轻、超重、肥胖及正常体重四个等级。其中bmi<18.5为体重过轻，bmi>24为超重，bmi>28为肥胖，bmi18.6～23.9为正常体重，具体计算方法为bmi＝体重(kg）/身高2（m2）。由三位经过培训的课题调查员测量研究对象的身高、体重并将计算结果同以上相应数据进行比较归类。

　　1.5.3  腰椎负荷强度［7］：根据瑞典斯德哥尔摩肌肉骨骼疾病研究中心的体力负荷评估问卷进行判断，包括坐位作业（sitting）、弯腰扭腰（bending/twisting）、全身振动（whole body vibration）、提举重物（lifting）及重体力作业（heavy work）等，分为轻度（low）、中度（middle）和重度（high）腰椎负荷三个等级。由三位经过培训的课题调查员通过问卷调查并提出分类意见。
   
　　同时记录研究对象的性别、年龄、民族、婚姻状况及家族史等。

   　 2  实验研究

　　2.1  主要仪器及试剂：多通道荧光定量pcr扩增仪，美国abi公司产品；原位pcr仪，德国eppendorf公司产品；超低温冰箱， 美国harris公司产品；冰冻高速离心机，德国eppendorf公司；凝胶电泳成像分析系统， 美国bio-rad公司出品；abi373oavant测序仪，美国abi公司。全血基因组dna提取试剂盒（bsco6s1），biospin公司产品；各基因片段所需引物，上海生物工程技术公司产品；限制性内切酶：saul 、tsp45i  fermentas公司产品；限制性内切酶：ddel，promega公司产品。

　　2.2  实验方法

　　2.2.1  标本收集方法：抽取符合纳入标准的患者外周血作为检测样本, 所有研究对象抽血前空腹10 h，均于上午7～8点抽取静脉血标本2 ml，然后注入含肝素抗凝剂的真空管中混匀，置于4℃冰箱保存待用。

　　2.2.2  检测指标及方法简介［8］：检测tgf-β1基因-509位点，运用聚合酶链反应结合限制片段长度多态酶切（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，pcr-rflp）技术进行基因多态性检测并对其进行基因分型，基因检测及分型由广西中医学院第一附属医院分子生物学实验室专人负责，采用单盲法。基因多态性分析的主要步骤包括：①外周血白细胞dna提取过程的操作方法按照试剂的说明书进行，全部受试者均取外周静脉血2 ml，edta抗凝，采用biospin抽提试剂盒提取基因组dna，按照既定方法和步骤提取dna；②聚合酶链反应(pcr)扩增，设计引物；③限制性内切酶消化；④凝胶电泳；⑤基因分型。

 　   3  统计学分析

  　  基因型与等位基因频率采用频率计数法计算，研究对象基因型与等位基因频率的比较均采用卡方检验，两组均数比较采用t检验，比值比(odd ratio,or)计算采用logistic回归分析。所有数据均应用spss 13.0 for windows统计软件包进行统计分析，p<0.05为差异有统计学意义。研究因素及数量化等级见表1。表1  研究因素及数量化等级研究因素数量化等级（略）

　　4  结果

  　  用非条件logistic回归forward（lr）法分析腰椎间盘突出症血瘀证潜在的危险因素，按α=0.05检验水准上，筛选出3个因素与lidp血瘀证的发生有统计学意义(p＜0.05)的危险因素,各危险因素的参数估计值及相对危险度的估计值结果见表2所示。表2  lidp血瘀证型相关危险因素（略）

　　5  讨论

   　 既往研究结果显示，椎间盘退变（intervertebral  disc  degeneration，idd)是lidp的根本原因，实验及临床研究表明慢性机械劳损、年龄、职业、吸烟等环境暴露因素与idd相关，但退变的具体过程及机制未明，目前也未见以上因素与lidp血瘀证关联性研究方面报道。中医临床上把腰椎间盘突出症归属于腰腿痛、痹证范畴， 且“痹久多瘀”，血瘀是腰椎间盘突出症的病因，也是腰椎间盘突出症的主要中医证型。国外学者研究报道［9］lidp很可能是传统危险因素与基因交互作用的结果，国内学者叶伟等［10、11］研究显示tgf-β1基因-509c/t单核苷酸多态性与椎间盘的退变相关，笔者［8］前期研究显示与转化生长因子β1 基因-509 位点tt 基因型相比，携带转化生长因子β1基因-509 位点ct基因型的广西壮族lidp患者患血瘀证的风险较高(p< 0.05)。本文进一步探讨部分危险因素及tgf-β1 -509c/t基因多态性与部分危险因素相互作用对lidp血瘀证发生的关系，结果显示重度腰椎负荷强度的广西壮族人群患lidp血瘀证的风险是轻中度腰椎负荷强度者的3.911倍（95%ci：1.334～ 1.872）(p<0.05)，广西壮族人群tgf－β1 基因-509c/t多态性与重度腰椎负荷强度的累积暴露发生lidp血瘀证的风险是其中某单一因素的18.425倍（95%ci：1.767～ 3.693）(p<0.01)，说明腰椎负荷强度可能也是广西壮族人群lidp血瘀证的潜在危险因素，携带tgf-β1 基因-ct基因型的广西壮族人在从事长期坐位（sitting）、持续弯腰扭腰（bending/twisting）及重体力作业（heavy work）等重度腰椎负荷强度工作的情况下，更容易患血瘀型腰椎间盘突出症。

【参考文献】
  　　［1］胡有谷.腰椎间盘突出症［m］.第3版.北京:人民卫生出版社,2005，9.

　　［2］胥少汀,葛宝丰,徐印坎，主编.实用骨科学［m］.第三版.北京：人民军医出版社,2005，4.

　　［3］中药新药临床研究指导原则［s］.北京：中华人民共和国卫生部，2002.

　　［4］中医病证诊断疗效标准·中医骨伤科病证诊断疗效标准·腰椎间盘突出症的诊断依据、证候分类、疗效评定［s］.北京: 中华人民共和国国家中医药管理局颁发，1994，6.

　　［5］battie mc,videman t,gill k,et al.smoking and lumbar intervertebral disc degeneration:a mri study of identical twins［j］.spine,1991,9:1015-1021.

　　［6］陈春明.中国成人体质量指数分类的推荐意见简介［j］.中华预防医学杂志,2001,5:349-350.

　　［7］christina bs，ewa wh，jorgen w，et al.reproducibility of questionnaire for assessment of physical load during work and leisure time［j］. j occupational and environment health，1996,38:190-201.

　　［8］许建文,谢伟星,钟远鸣,等. 广西壮族人群转化生长因子β1基因多态性与腰椎间盘突出症血瘀证的关联性［j］.中国组织工程研究与临床康复,2009,33:2219-2223.

　　［9］solovieva s,lohiniva j,leino a.col9a3 gene polymorphism and obesity in intervertebral disc degenerative of the lumbar spine: evidence of gene-environment interaction［j］.spine,2002,23:2691-2696.

　　［10］叶伟,彭焰,黄东生,等.tgf-β1基因-509c>t单核苷酸多态性与椎间盘疾病的关系［j］.中国矫形外科杂志,2006,7:531-534.

　　［11］li jm ,brooks g. differential protein expression and subcellular distribution of tgf beta1, beta2 and beta3 in cardiomyocytes during pressure overload-induced hypertrophy［j］.j mol cell cardiol，1997,8:2213-2224.