【摘要】 目的 检测人非小细胞肺癌标本中自噬相关基因beclin1的表达并讨论其意义及与细胞病理类型和临床分期的关系。 方法 采用免疫荧光染色、rtpcr和western blot法检测54例非小细胞肺癌的肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织beclin1蛋白、mrna表达。结果 免疫荧光染色显示beclin在肺癌组织中表达较低，表达率为8.3%，显著低于癌旁和正常组织(p=0.00)。beclin1 mrna在肺癌、癌旁及正常组织中的相对表达量为1.302±0.074、1.691±0.100、1.673±0.081(f=6.6, p=0.002)，western blot检测beclin1蛋白在肺癌、癌旁、正常组织中的相对表达量分别为3.489±0.293、5.306±0.459、6.329±0.580（f＝9.73，p<0.01）。beclin1蛋白和mrna表达与肺癌病理组织类型和临床分期无明显关系。结论 beclin1蛋白和mrna表达在肺癌组织中明显低于癌旁和正常组织，表达量的差异有统计学意义，在癌旁和正常肺组织中表达接近。
【关键词】 自噬 beclin1 非小细胞肺癌
肺癌是发病率较高的恶性肿瘤，在其发生和发展过程中，抑癌基因的失活、细胞内异常物质和内环境的改变、受损细胞器清除障碍、癌细胞凋亡受阻等因素都可能起到重要作用，这些过程都有自噬参与。beclin1是一种与自噬密切相关的抑癌基因，编码自噬相关蛋白。beclin1在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中表达均有缺失[1]，在蛋白和mrna表达水平研究自噬在肺癌中的表达目前鲜见报道。Www.11665.COm本研究检验了自噬相关基因beclin1在肺癌、癌旁组织、正常肺组织临床标本中的表达情况，并探讨其与肺癌的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象和标本采集
选择2006年4月～2006年10月手术切除的非小细胞肺癌标本54例，所有病例经病理学确诊,术前均未接受放、化疗。每例标本取肺癌组织及相应的近癌旁组织(距肿瘤边缘1～3cm)、正常组织(距肿瘤边缘> 5cm)各一个样本。54例患者中男39例,女15例。年龄37～75岁,平均（56.3±8.1）岁。肿瘤组织病理类型均为非小细胞肺癌，其中：腺癌32例，鳞癌17例，大细胞癌3例，腺鳞癌2例。依据1997 年uicc tnm 分期: ⅰ期11 例, ⅱ期27例, ⅲa期16例。所取组织标本手术切除后立即用生理盐水洗净血污后装ep管置液氮罐保存备用。
１．２ 主要试剂
beclin1一抗购于美国santa cruse公司，逆转录pcr试剂盒(takara公司)和 rna试剂盒（包括了taq酶）购置北京赛百盛基因技术有限公司,beclin1引物由上海生工生物技术有限公司合成。
１.３ 免疫荧光染色
取各组肺癌组织，冰冻切片（厚度0.1mm），1/2丙酮+1/2酒精固定5min，0.3％ triton破膜，加入beclin1一抗4℃过夜（1∶200），以pbs 代替一抗作为空白对照，阴性抗体作为阴性对照。pbs漂洗后加兔抗羊igg fict荧光二抗(1∶100)，避光37℃ 0.5h。激光共聚焦显微镜下波长为353.6nm观察拍照。
１.４ rt－pcr方法
rtpcr方法：每份冻存标本取1mm3剪碎研磨,加入1ml trizol溶液裂解,按trizol试剂盒说明书采用一步法提取总rna,以dna/rna测定仪测定rna的纯度和浓度。按逆转录合成试剂盒说明合成cdna，待用。gapdh作为内参照，目的片段为452bp,引物序列：5′accacagtccatgccatcac3′(上游), 5′tccaccaccctgttgctgta3′（下游）。beclin 1: 5′atcctggaccgtgtcaccatccagg3′ (上游)， 5′gttgagctgagtgtccagctgg3′ （下游）, 363bp；maplc3: 5′gaagatgtccgacttattcgagag3′(上游)5′actctcatacacctctgagattgg3′（下游）, 352bp。pcr条件：94℃ 1min, 55℃ 1.5min， 72 ℃ 0.5min，共30个循环。结果用quanlityone分析，以阳性条带与gapdh光密度比值作为阳性条带的相对表达值，spss11.5统计学分析。
1.5 western blot检测
ripa buffer 200μl裂解细胞, 考马斯亮蓝法蛋白定量, 常规电泳、 转印和封闭后, 加入beclin1(1∶100)4℃孵育过夜; 抗人碱性磷酸酶标记二抗(1∶3000, 北京中杉金桥生物技术有限公司), 室温孵育2h, 碱性磷酸酶染色5min, 胶片曝光显影， 结果用quanlityone分析， βactin为内对照， 以阳性条带与内对照光密度比值作为阳性条带的相对表达值。
１.６ 统计学方法
采用spss11.5作统计学分析。
2 结果
2.1 免疫荧光结果
免疫荧光染色显示正常组织和癌旁组织均有beclin1表达（表达率100％），见图1a～c，beclin1在49例肺癌标本中不表达（90.7%）。不表达的癌细胞呈空泡状未染色状态，见图1d～f。beclin1在肺癌和非癌组织中的表达差异有统计学意义（χ2=60.9, p=0.00）。
2.2 rtpcr检测结果
beclin1 mrna表达出现在所有组织中。gapdh mrna半定量后beclin1 mrna在肺癌、癌旁、正常组织的相对表达量分别为1.302±0.074、1.691±0.100、1.673±0.081(f=6.6, p=0.002)。beclin1在肺癌组织和其他组织中表达量差异有统计学意义, 在癌旁组织和正常组织中的相对表达量差异无统计学意义， beclin1 mrna在癌旁组织和正常组织中的表达量均强于肺癌组织，见图2。
图1 beclin1在肺癌组织未表达（箭头所示）呈空泡状,正常组织表达良好
图２ beclin1 mrna在正常组织、癌旁组织、肺癌组织的表达
２．３ western blot检测结果
肺癌组织中的beclin1蛋白低表达（肺癌组织：3.489±1.760；癌旁组织：5.306±2.755；正常组织：6.329±3.483），癌旁或正常组织中高表达（f＝9.73，p<0.001），相对表达量差异有统计学意义（p＝0.000）（图３）。
图3 beclin1蛋白在正常组织、癌旁组织、肺癌组织的表达
２.４ beclin1在不同病理类型和临床分期中表达
在本研究中，nsclc的不同细胞病理类型以及临床分期之间，beclin1的mrna表达以及蛋白表达差异无统计学意义，见表１。
3 讨论
ｂeclin１位于人类染色体17q21上,大约有150kb，被认为是一种双等位抑癌基因（haploinsufficient tumor suppressor），其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一[2]。据报道75%的人类卵巢癌[3,4]、50%乳腺癌[5]和40%前列腺癌[6]细胞存在beclin1单等位基因缺失突变,其表达量不同程度下降[7]。恶性肿瘤中beclin1的双等位基因突变则较为罕见。关于肺癌的beclin1基因突变少见报道。本研究发现beclin1蛋白在正常肺组织中表达的相对量显著高于肺癌样本，和癌旁组织差异无统计学意义；肺癌组织的免疫组化染色普遍呈阴性，照片显示和正常组织形成鲜明对比的空泡状无染色区； rtpcr 结果也提示肺癌组织beclin1基因转录的减少。同时我们也观察到，beclin1的表达情况与肺癌的病理组织类型和临床分期没有明显的相关性，尚难对其与癌细胞生物学特性的关联作出推断。
beclin1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，主要通过调节自噬水平而对肿瘤的发生、发展起着重要作用[2]。自噬现象是一种高度保守的细胞行为，几乎存在于所有的物种，构成了从简单的单细胞生物、植物到哺乳动物细胞中广泛存在着的降解/再循环系统的重要组成部分[7]，并且是完整细胞器和大分子蛋白降解的主要途径[8]。自噬的失调和肿瘤的发生、发展、转归关系密切[9，10]。beclin1通过调节自噬水平参与细胞内大分子物质的循环及再利用、受损细胞器的清除，并维护细胞内环境稳态[11]，自噬体的形成与atg(autophagyrelated gene)系列基因有关，ｂeclin１是酵母atg6的同系物,也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，ｂeclin1基因主要与ⅲ型pi3k(phosphatidylinositol 3kinase)形成复合体来调节其他的atg蛋白在自噬前体结构中定位，来调节自噬活性[12]。已经证实上调beclin1在哺乳动物细胞中的表达能够刺激自噬的发生[13]。
和传统的抑癌基因不同， beclin1基因是一类新的抑癌基因， 只有在双等位染色体都表达时才能够发挥抑癌作用。 beclin1等位基因敲除的小鼠发生自发性恶性变（包括乳腺肿瘤、肺癌、肝癌等）几率增加，且易受hbv诱导的前恶变性损伤。beclin1蛋白在人类乳腺癌中表达较正常乳腺细胞低，将表1 不同病理类型和临床分期肺癌组织的beclin1 mrna和蛋白表达beclin1转染人乳腺癌细胞株mcf7 后抑制mcf7细胞在体外增殖,并降低mcf7细胞的成瘤性[13],这些发现都提示了beclin1的抑制肿瘤作用。beclin1基因还和一些肿瘤相关信号传导通道关系密切， 例如： pten通道[14]和 rb信号传导通道[15，16]都与beclin1不同程度相关。beclin1也能够协同其他药物的抗肿瘤作用，上调beclin1的表达能够增强顺铂诱导的胃癌细胞系mkn28凋亡，抑制beclin1则削弱了顺铂的细胞毒作用[17]。
关于beclin1对于肺癌的早期诊断和预防的价值，调控beclin1的表达对于不同时期肺癌细胞发展的影响，以及协同其它抗肿瘤手段对于肺癌的治疗效果，目前仍然缺少相关资料。进一步的研究将对阐明肺癌的发生、发展机制并为最终开发新的治疗手段提供理论依据。
【参考文献】
［1］ aita vm, liang xh, murty vv, et al. cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21[j]. genomics，1999，59（1）:5965.
[2] yue z,jin s,yang c,et al.beclin1,an autophagy gene essential for early embryonic development,is a haploinsufficient tumor suppressor[j].proc natl acad sci usa,2003,100（25）:1507715082.
[3] tangir j,muto mg, bercowitze rs,et al. a 400 kb novel deletion unit centromeric to the brca1 gene in sporadic epithelial ovarian cancer［j］. oncogene，1996，12（4）:735740.
[４] futreal pa,marks jr,marks jr, et al. detection of frequent allelic loss on proximal chromosome 17q in sporadic breast carcinoma using microsatellite length polymorphisms［j］. cancer res，1992， 52（9）:26242627.
[５] h saito, j inazawa, s saito, et al. detailed deletion mapping of chromosome 17q in ovarian and breast cancers: 2cm region on 17q21.3 often and commonly deleted in tumors［j］. cancer res, 1993， 53（14）:33823385．
[６] gao x, zacharek a, salkowski a, et al. loss of heterozygosity of the brca1 and other loci on chromosome 17q in human prostate cancer［j］. cancer res，1995， 55（19）:10021005.
[７] cuervo am, dice jf, knecht e. et al. a receptor for the selective uptake and degradation of proteins by lysosomes［j］. science,1996，273（26）:501503.
[8] takahiro shintani, daniel j. klionsky. autophagy in health and disease:a double edged sword［j］.science,2004,306（5）:990995.
[9] mizushima n, yamamoto a, hatano m, et al. dissection of autophagosome formation using apg5deficient mouse embryonic stem cells[j]. j cell biol, 2001, 152(4): 657668.
[１0]toth s, nagy k, palfia z,et al. cellular autophagic capacity changes during azaserineinduced tumour progression in the rat pancreas. up regulation in all premalignant stages and downregulation with loss of cycloheximide sensitivity of segregation along with malignant transformation［j］. cell tissue res, 2002, 309(3): 409416.
[１1]klionsky dj, emr sd. autophagy as a regulated pathway of cellular degradation［j］. science,2000,290（1）:17171721.
[１2]edinger a l,thompson c b.defective autophagy leads to cancer[j].cancer cell,2003,4（6）:422424.
[１3]liang xh,jackson s,seaman m,et al.induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin1[j]. nature,1999,402（6）:672676.
[１4]arico s,petiot a,bauvy c,et al.the tumor suppressor pten positively regulates macroautophagy by inhibiting the phosphatidylinositol 3kinase/protein kinase b pathway[j]. j biol chem, 2001，276（38）, 3524335246.
[１5]weinmann a s, bartley s m, zhang t, et al.use of chromatin immunoprecipitation to clone novel e2f target promoters[j]. mol cell biol, 2001，21（20）, 68206832.
