as2o3对人子宫内膜癌细胞hec1b皮下移植瘤抗肿瘤作用
【关键词】 三氧化二砷;子宫内膜肿瘤;细胞凋亡;perk
【摘要】 目的 检测不同浓度as2o3对人子宫内膜癌hec1b细胞裸鼠皮下移植瘤的抗肿瘤作用及对瘤细胞内磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(perk)表达的影响，进一步探讨as2o3的抗肿瘤机制。方法 建立人子宫内膜癌hec1b细胞皮下移植瘤模型，随机分为实验组,即as2o3低剂量(1.0 mg/kg)、中剂量(2.5 mg/kg)、高剂量(5.0 mg/kg)剂量组,生理盐水(ns)组及顺铂组(5 mg/kg),腹腔内注射给药，连续8 d。观察用药前后裸鼠体质量改变。剥取瘤组织,计算药物的抑瘤率。检测用药后裸鼠的肝肾功能及血常规。透射电镜观察细胞变化，流式细胞仪检测细胞凋亡周期和细胞凋亡率，免疫组化法检测perk的表达。结果 不同浓度as2o3和顺铂均有不同程度抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡的作用，其中as2o3低剂量组的抑瘤率为34.3%，perk的表达率为37.5%，该组在亚g1期出现典型的凋亡峰，且as2o3低剂量组与ns组比较，凋亡率、瘤质量差异均有显著意义（f=27.20、33.92,q=9.19、13.34，p<0.05）。as2o3低剂量组与顺铂组相比，无明显血液及肝肾毒性。结论 低剂量as2o3组能明显抑制肿瘤细胞hec1b生长，且毒副作用轻，可能与阻滞细胞周期，抑制perk表达有关。wWw.11665.COM
【关键词】 三氧化二砷;子宫内膜肿瘤;细胞凋亡;perk
the antitumor effect of arsenic trioxide on transplanted human endometrial cancer cell line
wang mingfang, zhao yuanyuan, zhang biyuan, et al
(department of oncology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to investigate the antitumor effect of differentconcentration arsenic trioxide (as2o3) on transplanted human endometrial cancer cell line (hec1b) in nude mice and on the expression of perk, and further explore the mechanism of the action. methods a model of subcutaneously transplanted tumor of hec1b was created in nude mice that were randomized to five groups as lowdose, mediumdose, highdoseas2o3 groups(1.0, 2.5, and 5.0 mg/kg, respectively), normalsaline (ns) group and ddp group. intraperitoneal medication was given, according to their body weight, for eight days. the changes of body weight before and after medication were measured. the tumors were collected, tumorinhibiting rates calculated, liver and renal functions as well as blood routine detected. the changes of the cells were observed electronmicroscopically; the cycle and rate of apoptosis detected by flow cytometry; and perk by immunohistochemical technique. results different concentrations of both as2o3 and ddp showed different extents of suppressing the growth of tumor cells and enhancing apoptosis, in which, the tumorinhibiting rate for lowdoseas2o3 group was 34.3%, and the expression of perk was 37.5%, with typical subg1 peakemerging in this group. the differences between this group and ns group were significant in terms of apoptosis and tumor weight(f=27.20,33.92;q=9.19,13.34;p<0.05). compared with ddp group, the lowdoseas2o3 group showed no significant hematotoxicity, liver and renal toxicity. conclusion low dose of as2o3 can markedly restrain the growth of hec1b cells with slight side effects, which is probably associated with blockage of cell cycle and inhibition of the expression of perk.
［key words］ arsenic trioxide; endometrial neoplasms; apoptosis; perk
三氧化二砷(as2o3)是传统中药砒霜的有效成分之一。近几年的临床应用表明，as2o3在治疗血液病中疗效确切，而且对于某些实体瘤亦有一定疗效[13]。子宫内膜癌(ec)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，该肿瘤占女性生殖系统恶性肿瘤20％～30％[4]。as2o3在细胞及小鼠水平上已被证实有抗子宫内膜癌的作用[5]，但在人体内关于as2o3抗子宫内膜癌的实验报道较少。本实验通过建立人子宫内膜癌皮下移植瘤体内模型，探讨as2o3在体内的抗肿瘤作用及抗肿瘤机制。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
人子宫内膜癌hec1b细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。balb/cnu雌性裸鼠40只, 4～6周龄,体质量15～18 g,购自苏州贝尔达实验动物有限公司,饲养于spf级动物实验室。as2o3 购自哈尔滨伊达药业有限公司，顺铂注射液购自豪森药业股份有限公司，磷酸化细胞外信号调节激酶（perk）免疫组化反应体系购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养方法与动物实验模型的建立
将hec1b细胞株贴壁培养于含有体积分数0.10胎牛血清及105 u/l青链霉素的dmem培养液中，置于37 ℃、体积分数0.05的co2温箱中，2 d更换一次培养液。当细胞80%融合时传代培养。收集对数生长期的细胞，胰酶消化，制备成密度3×107/l单细胞悬液，取0.2 ml该细胞悬液，在超净工作台内接种于裸鼠腋下，8 d后形成直径0.5 cm以上的移植瘤为模型制备成功。
1.2.2 裸鼠分组及给药
8 d后裸鼠腋下均形成直径0.5 cm以上的移植瘤。将负瘤裸鼠随机分为5组，每组8只，分别设为阴性对照生理盐水（ns）组，阳性对照顺铂组（5.0 mg/kg），as2o3低剂量组(1.0 mg/kg)组、as2o3中剂量（2.5 mg/kg）组、as2o3高剂量（5.0 mg/kg）组。将as2o3和顺铂按比例在无菌条件下配成目标浓度，用无菌注射器抽取0.2 ml注入裸鼠腹腔，共给药8 d。第9天将裸鼠测定质量，取血并处死，留取其血液注入含与不含edtak2的ep管中， 剥离肿瘤用电子天平仪测定质量并记录后，分别用中性甲醛溶液、无水乙醇、液氮速冻固定备用。留取肝肾组织固定于中性甲醛溶液中，备用。给药期间每天观察裸鼠的活动、饮食等一般情况。
1.2.3 血常规及肝肾功能检测
将含有edtak2的血样送检验科检测血常规，将不含抗凝液的血样吸取血清，送生化实验室检测肝肾功能。
1.2.4 细胞周期及凋亡率测定
将-20 ℃冰箱中经体积分数0.70的冰乙醇固定的部分肿瘤标本，在超净工作台内用研磨棒研碎，用400目滤网过滤，低速离心去除碎片，pbs洗涤后，制成单细胞悬液，室温避光pi染色30 min,通过流式细胞仪（美国，b.d.vantage型）检测细胞周期及凋亡率。
1.2.5 免疫组化sp法测定perk 的表达
将部分肿瘤标本固定于40 g/l的甲醛溶液12 h，石蜡包埋，超薄切片（厚0.4 μm），脱蜡，微波修复，按照sp法说明书进行perk抗体免疫组化染色。用1∶400的perk抗体测定标本内perk表达。胞浆和胞核出现黄色颗粒为阳性表达，着色强度分为：无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞百分率＜5％为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。两项结果相乘，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～6分为中等阳性（），>6分为强阳性（）。
1.2.6 透射电镜观察肝肾细胞结构
取固定好的部分瘤组织，分别石蜡包埋、超薄切片、脱蜡、苏木精伊红染色，透射电镜观察细胞超微结构变化。
1.3 统计学处理
数据以±s表示，多样本均数比较采用方差分析，两组间比较采用studentnewmankewls 检验，采用spss 1.6及ppms 1.5[12]统计软件进行统计处理。
2 结果
2.1 负瘤裸鼠一般情况观察及抑瘤作用
2.1.1 裸鼠一般情况及体质量变化
移植瘤初期多为圆形，后渐不规则，表面凹凸不平，呈多个结节融合状，无破溃和坏死。腹腔给药期间，ns组和as2o3低剂量组裸鼠饮食正常，精神良好，活跃，动作灵敏，大小便正常，体质量有所增加。as2o3中、高剂量组裸鼠饮食减少，精神萎靡，动作较迟钝，体质量下降，大小便正常。顺铂组裸鼠饮食最少，精神萎靡，动作呆滞，不活跃，消瘦，大小便量少，其中4只裸鼠出现不同程度腹泻，并有恶病质表现。用药前后各组裸鼠体质量比较，差异均有显著意义（t=2.12～4.24，p<0.05）。见表1。表1 用药前后裸鼠的体质量变化（略）
2.1.2 as2o3抑瘤作用
按公式计算抑瘤率：抑瘤率=(1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%。用药后as2o3低剂量组和顺铂组肿瘤生长均明显减慢，瘤质量均低于其他组（f=27.20,q=7.99～9.19,p<0.01）;as2o3低剂量组与顺铂组比较差异无显著性（p>0.05）。as2o3低剂量组与顺铂组抑瘤率比较，差异无显著意义（p>0.05）。见表2。表2 as2o3对子宫内膜癌裸鼠移植瘤的抑制作用(略)
2.2 as2o3诱导细胞凋亡的作用
as2o3组和顺铂组均出现典型的细胞凋亡表现——g1前期的亚二倍体峰，但不同浓度的as2o3作用强度不同。ns阴性对照组移植瘤的细胞凋亡率为（7.32±0.33）%、顺铂组为 （11.84±0.26）%、as2o3低剂量组为（13.38±0.37）%、as2o3中剂量组为（8.55±0.41）%、as2o3高剂量组为（7.98±0.19）%，组间比较差异有显著意义（f=33.92,p<0.01）。as2o3低剂量组和其他各组比较差异有显著性（q=3.39～13.34,p<0.05），as2o3中、高剂量组与ns组比较差异无显著性（p>0.05）。
2.3 各组perk的表达
as2o3低剂量组细胞浆内黄色颗粒着色最浅，阳性细胞数最少，与顺铂组差别较小。而ns阴性对照组细胞浆内黄色颗粒着色最深，且阳性细胞数最多。ns组perk的阳性表达率为 87.5%，顺铂组为50%，as2o3低剂量组为37.5%，as2o3中剂量组为62.5%，as2o3高剂量组为62.5%， 其中as2o3低剂量组与ns组比较差异有显著性(χ2=4.267，p<0.05）。
2.4 as2o3对负瘤裸鼠血常规及肝肾功能的影响
as2o3组和顺铂组均出现骨髓抑制情况，三系出现不同程度的降低，as2o3低剂量组出现ⅰ度骨髓抑制和轻度肝肾功能异常，顺铂组和as2o3中、高剂量组出现了ⅱ～ⅳ度骨髓抑制及轻中度肝肾功能异常，主要以中性粒细胞降低及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿肌酐升高为主。
2.5 透射电镜观察
透射电镜观察显示，as2o3低剂量组细胞核固缩，染色质边集，部分细胞内可见凋亡小体，坏死细胞较少，顺铂组和as2o3中、高剂量组细胞坏死明显，细胞碎片较多见。裸鼠肝肾组织切片观察发现，as2o3低剂量组肝肾结构较清晰，细胞坏死较少。顺铂组裸鼠肝小叶分割错落，肾单位紊乱，有不同程度的细胞坏死。
3 讨论
ec近年来发病率逐年上升，并超过宫颈癌，已成为常见的女性生殖系统肿瘤[6]。早期诊断治疗5年生存率较高，但是晚期ec应用常规的抗肿瘤药物，如铂类、紫杉醇及蒽环类等，其有效率仅为25%左右，传统药物的耐药性及副作用大等因素限制了化疗有效率的提高。细胞凋亡是生物体维持自我稳态的重要机制。当子宫内膜正常细胞凋亡受阻,将导致肿瘤的发生。文献报道，as2o3能够通过多个靶点多途径诱导肿瘤细胞凋亡,同时也是as2o3抗妇科恶性肿瘤的主要机制，如调节凋亡调控基因和（或）蛋白的表达、阻滞细胞周期、抗肿瘤血管生成等[7]。体外相关实验结果已证实，中、低浓度(2～4 μmol/l)的as2o3可以诱导细胞的凋亡，出现典型的g1前期的亚二倍体峰，而高浓度的as2o3主要导致细胞坏死[8]，丁晓娣等[9]在卵巢癌体内移植瘤实验中也有类似报道。本实验中as2o3低剂量组存在显著的抑瘤作用，与传统的化疗药物效果相当，但中、高剂量组并未表现出类似优势。进一步说明as2o3抗肿瘤作用不存在量效关系，低浓度可能是其最适浓度范围。这与临床中as2o3治疗白血病的浓度相类似。本实验as2o3低剂量组有较高的凋亡率，并出现典型的g1前期的亚二倍体峰，说明它可能通过阻断细胞周期，阻滞细胞增殖，并引起细胞的凋亡；as2o3中、高剂量组细胞凋亡率较低，大部分死亡细胞呈坏死状态。as2o3低剂量组可能通过阻滞细胞周期来诱导细胞凋亡，是其抗肿瘤作用机制之一。同时，在实验中我们观察了as2o3对裸鼠机体的影响，其毒副作用明显低于顺铂，尤其是血液毒性和肝肾毒性。as2o3各剂量组与顺铂组相比，未出现恶病质表现，并且体质量较用药前增加，提示as2o3有抗恶病质的可能。
细胞外信号调节激酶(erk)是丝裂原活化蛋白激酶(mapks)家族的一个亚族，包括erk1和erk2。其中rptkrasrafmek1/2erk1/2经典信号通路是调控细胞生长、增殖和分化的重要通路，erk1/2磷酸化是该通路的关键靶点。erk信号通路被上游激酶或生长因子相关刺激激活后，erk被磷酸化（即perk）转位至细胞核，作用于转录因子(如ntkb、cmyc等)，刺激转录启动和转译激活途径，导致细胞增殖[10]。在多种恶性肿瘤组织中有erk的活化，并且perk可以作为某些恶性肿瘤恶性程度及进展的标志物。文献报道，下调erk活化是as2o3诱导白血病细胞u937凋亡的机制之一[11]。本实验研究显示，ns组perk表达最高，as2o3低剂量组perk表达最低，提示as2o3可能阻断了erk的磷酸化。as2o3通过阻断erk活化，下调perk的表达，可以减少细胞增殖，从而起到抗肿瘤生长的作用。但对于as2o3如何阻断erk活化的机制还有待于进一步的研究。
综上所述，as2o3对裸鼠ec移植瘤模型有较高的抑瘤作用，并且毒副作用轻。可能通过诱导肿瘤细胞凋亡、下调perk、阻断细胞增殖等多种机制抑制肿瘤的生长，为ec的临床治疗提供了一条有效安全的途径。但as2o3对ec的其他作用机制还有待于进一步的研究。
【参考文献】
[1] 李宇航,鞠培新. 三氧化二砷诱导人肝癌细胞株hepg2凋亡的机制研究[j]. 中国肿瘤临床, 2008,35(4)：210213.
[2] 姚茂金,李洁,方建珍. 三氧化二砷诱导人膀胱癌t24细胞凋亡的实验研究[j]. 实用癌症杂志, 2007,22(4):332335.
[3] jaspreet s s, rafael a p. cell cycle inhibition by sodium arsenite in primary embryonic rat midbrain neuroepithelial cells jaspreet[j]. toxicologicalsciences, 2006,89(2):475484.
[4] lanad p. a death in life of p53[j]. nature, 1993,362:786788.
[5] zhou c x, john f, vbaeju m p. induction of apoptosis and inhibition of telomerase activity by arsenic trioxide (as2o3) in endometrial carcinoma cells[j]. gynecologic oncology, 2007,105:218222.
[6] jemal a, siegel r. cancer statistics[j]. ca cancer j clin, 2006,56(2)：106.
[7] 杜晓梅. 三氧化二砷在妇科恶性肿瘤的研究进展[j]. 实用癌症杂志, 2006,21(2):122124.
[8] 寻克丽,张信江. 三氧化二砷对体外培养的人子宫内膜腺癌细胞凋亡的影响[j]. 中国地方病学杂志, 2006,5(1):156160.
[9] 丁小娣,赵园园. as2o3对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤抑制作用及机制[j]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(4)：301303.
[10] beeram m, patna i k, row i e. regulation of craf1：therapeutic implications[j]. clin adv hematol oncol, 2003,1(8)：476481.
[11] iwama k, nakajo s, aiuchi t, et al. apoptosis induced by arsenic trioxide in leukemia u937 cells is dependent on activation of p38,inactivation of erk and the caspase pendent production of superoxide[j]. int j cancer, 2001,92：518526.
[12] 周晓彬,纪新强,徐莉. ppms 1.5统计软件的功能及其应用[j]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.
