【摘要】 为了研究干扰素α对白血病细胞u937細胞的抗增殖作用及其机制，用不同浓度的干扰素α(500 u/l、1 000 u/l、2 000 u/l、3 000 u/l、4 000 u/l) 对u937細胞作用不同时间（0、12、24、36 和48小时）, 用mtt法检测细胞生长抑制率，应用流式细胞术（fcm）检测细胞凋亡率，rtpcr方法分析cyclin e mrna的表达。结果表明：不同浓度的干扰素α处理细胞后，u937细胞生长明显受抑， 2 000 u/l干扰素α能引起细胞凋亡，凋亡率为25.28%-70.54%（p<0.01），细胞周期相关基因cyclin e mrna表达降低；干扰素α对u937细胞的抑制率,呈浓度时间依赖性。结论： 干扰素α对u937细胞有明显抗增殖和促凋亡作用，此结果将为干扰素α在白血病临床治疗方面的应用提供有力的实验证据。
【关键词】 干扰素α u937细胞
apoptosisinducing and antiproliferation effect of interferonα on u937 cells and its mechanism
fan ke, chen peihong1, yuan chun2
department of internal medicine, liyuan hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430077, china; 1department of surgery, wuhan traditional chinese medicine hospital of hubei province, wuhan 430000, china; 2department of surgery, academy of traditional chinese medicine of hubei prouince, wuhan 430017, china
abstract this study was aimed to investigate the antiproliferation effect of interferonα(ifnα) on leukemic u937 cells and its mechanism．the u937 cells were given with various concentrations of ifnα(500, 1 000, 2 000, 3 000 and 4 000 u/l) and at different time (0, 12, 24, 36, 48 hours), the inhibitory ratio was measured by mtt assay, apoptosis rate was detected by flow cytometry(fcm), the expression of cell cycleassociated cyclin e mrna was measured by rtpcr. the results showed that ifnα (2 000 u/l) could cause apoptosis, after being treated by various concentrations of ifnα, the growth of u937 cells was inhibited significantly, the apoptosis rate was 25.82%-70.54% (p<0.01), the cycleassociated cyclin e mrna expression decreased, the growth of u937 cells was significantly inhibited, the suppression of u937 by ifnα was both in timeand dosedependent manner．it is concluded that ifnα has apparent antiproliferation and apoptosisinducing effects on u937 cells. these results will provide strong laboratory evidence for ifnα clinical application in leukemia therapy.
key words interferonα；u937 cell；leukemia
j exp hematol 2007; 15(1):52-55
干扰素α是目前用于临床治疗最重要的细胞因子之一。WWW.11665.COM它具有广泛多变的生物学作用，诸如免疫调节、抗感染、抗病毒作用，尤其是对病毒性肝炎具有良好的治疗作用［1］。最新研究表明，干扰素α是一种非常有效的抗肿瘤细胞因子，并且对许多恶性疾病，例如肺癌、慢性粒细胞白血病均有显著效果［2］。干扰素α虽然已经广泛用于各种恶性肿瘤，但其抗肿瘤机制还不清楚。干扰素α可能间接地通过调节免疫调制和抗血管生长反应或直接通过影响肿瘤细胞的增殖和细胞分化来介导抗肿瘤作用。干扰素α的直接和间接作用都是由干扰素刺激基因（ifntimulated gene, isg)亚群诱导引起的。除此之外，还有isgs还具有致凋亡作用［3，4］。
为了阐明干扰素α的抗白血病机制，我们研究了从500 u/l-4 000 u/l的各种浓度干扰素α在体外对u937细胞的抗增殖作用和促凋亡作用，并检测细胞周期相关基因cyclin e mrna的变化，为干扰素α的白血病临床治疗提供实验证据。
材料和方法
药物
干扰素α购自基因公司。u937细胞购自中国细胞培养中心。cyclin e抗体购自晶美公司。
细胞培养
人类白血病细胞u937细胞株接种于含有10%灭活
的胎牛血清、青霉素100 u/ml及链霉素100 u/ml的rpmi 1640培养液中，于37℃、5% co2、饱和湿度下培养,每2周传代1次并常规检查是否有支原体污染。
中国实验血液学杂志 j exp hematol 2007; 15(1)干扰素-α对u937細胞的抗增殖作用及其机制细胞增殖抑制率的mtt比色法检测
取对数生长期的u937细胞,调整细胞浓度为5×105/ml，置于96孔培养板,每孔加入上述细胞悬液100μl。将不同浓度的干扰素α（500、1 000、2 000、3 000及4 000 u/l）加入不同的孔中,另选1组作为对照组。每种药物浓度为1组,每组设6个平行孔。培养12、24、36 和48小时后从培养箱中取出96孔培养板,然后每孔加入mtt(5 mg/ml)10 μl,再培养4小时后取出,离心吸去上清液,每孔加入dmso 100 μl,充分溶解。选择490 nm波长，酶联免疫检测仪上测定各孔a值。计算公式为：
肿瘤细胞的生长抑制率=（1-实验组
平均a值/对照组平均a值）×100%。
细胞凋亡的流式细胞术检测
收集经不同浓度干扰素α、不同处理时间的u937细胞,以pbs缓冲液清洗后再将细胞沉淀充分混匀,用pbs缓冲液重悬,加入200 mg/l去dna酶的rna酶,流式细胞仪分析不同dna含量的细胞分布。应用modifit tl1.00 (mac)分析系统进行数据处理,低于g1期的细胞(亚g1期)为凋亡细胞,其占细胞总数的比例为凋亡细胞比例。
细胞总rna抽提及rtpcr
步骤按trizol (gibco公司)试剂盒说明书进行。以浓度为2 000 u/l的干扰素α作用于u937细胞,经0、12、24、36 和48小时,所提取的总rna溶解后用紫外分光光度仪测rna纯度和浓度(a260/a280>1.8)。在genbank检索基因cdna序列,自行设计pcr引物, 由上海生物工程公司合成。
cyclin e引物序列(上游引物: 5′aataga gaggaagtctgg3′下游引物: 5′agatagtca acctgcatg3′, 扩增产物为449 bp。βactin上游引物: 5′cgctgcgctggtcgtcgact3′,下游引物: 5′gtcacgcacgatttcccgct3′,扩增产物为150 bp。pcr扩增条件为：94℃,45秒，56℃,45秒,72℃,1分钟,94℃,1分钟,共 35个循环。产物用1%的琼脂糖胶进行检测。用数码凝胶图象分析系统（kodak edas290）作条带密度扫描，结果以目的条带与对应的βactin密度值表示。
统计学分析
spss 11.5统计软件进行方差分析和t检验。
结 果
细胞生长抑制率的测定
干扰素α在浓度2 000 u/l以下时,对u937细胞的生长抑制率各组间差异无显著性，500 u/l 时为 (26.78±1.02）%,1 000 u/l时为（38.57±2.14)%,(p>0.05)。当浓度为(2 000 u/l-4 000 u/l)时,干扰素α能够抑制u937细胞的增殖, 差异有显著性,特别是浓度为4 000 u/l时,其抑制率明显高于其他浓度组(58.34±0.05,65.58±0.03,70.49±0.01)%,并呈浓度时间依赖性(p<0.01)（图1）。
figure 1. growth suppression rate of u937 cells caused by various concentration ifnα.
u937细胞凋亡率的变化
24-36小时时,干扰素α 2 000 u/l能够诱导细胞凋亡,但时间延长至36-48小时, 干扰素α>2 000 u/l时,其凋亡率超过50%(图2)。
干扰素α对u937细胞cyclin e mrna表达的影响
当u937细胞经干扰素α 2 000 u/l作用不同时间后,其cyclin e mrna的表达呈时间依赖性降低(p<0.01)（图3、4）。figure 2. apoptosis rate of u937 cells caused by various concentration ifna.
figure 3. electrophoretic pattern of cyclin e mrna expression in u937 cells by rtpcr.lane 1: control. lane 2: 12 hours. lane 3: 24 hours. lane 4: 36 hours. lane 5: 48 hours.
figure 4. density after treatment with 2 000 u/l ifnα at different time （±sd,n=3）. * p<0.01, compared with control. 讨 论
细胞因子是免疫系统的蛋白/糖蛋白信使,对调节免疫而言有不同的自分泌和旁分泌功能。细胞因子蛋白重组体是用于治疗癌症、病毒性疾病和自身免疫性疾病的生物制剂。干扰素α能通过对肿瘤相关血管生成的调控来调节肿瘤的生长，它利用宿主免疫学反应的活性作用或通过对肿瘤细胞增殖的直接抑制作用发挥抗癌作用［5］。此外，干扰素α可以通过干扰素调节因子（ifn regulatory factor, irf)激活许多免疫活性细胞，例如tc和nk，使其增殖和成熟，从而加强固有的免疫应答并在各种恶性肿瘤中发挥抗肿瘤作用［6］。新近研究的数据表明，干扰素α在许多癌细胞包括一些白血病细胞系，例如髓系白血病细胞中可诱导其凋亡［7］，但对这些肿瘤细胞作用的机制非常复杂。有研究证明，干扰素α能够使fasl表达增加，通过fas/fasl途径诱导肿瘤细胞凋亡，从而加速跨膜凋亡信号的传递，促进凋亡的发生［8］。另外，干扰素α可以通过调节凋亡调控因子的变化，如提高肿瘤坏死因子的活性，激活caspase系统，调节白细胞介素活性及改变凋亡调控基因的表达等多种途径诱导肿瘤细胞凋［4］。
干扰素α广泛用于许多恶性血液疾病尤其在粒细胞白血病的治疗上。在研究中，我们发现干扰素α能抑制白血病细胞株u937细胞的增殖并引起凋亡。凋亡率随药物浓度及时间而变化。
肿瘤细胞的特性之一是细胞周期异常,使肿瘤无限制地增殖；肿瘤治疗的中心环节是干扰肿瘤细胞的细胞周期,从而使肿瘤细胞增殖速率减慢或诱导细胞走向程序性死亡(或凋亡)［9］。细胞周期的启动,主要的调控点在g1期,它是细胞唯一能从外界接受增殖信号或抑制信号的时期。g1期主要蛋白是cyclin e,与相应的cdk结合形成cyclincdk复合物(cyclin ecdk2),这一步是g1/s期转化的关键［10］。cyclin e的异常表达可引起g1期的调控紊乱，导致包括恶性肿瘤在内的一系列疾病的发生。
目前发现cyclin e的表达异常是多种人类肿瘤的共同特点,在乳腺癌、结肠癌、胃癌及白血病等肿瘤中均可发现cyclin e的基因扩增和蛋白表达下调［11］。keyomarsi等［12］对乳腺癌实体瘤cyclin e进行western blot 检测，发现90%肿瘤组织cyclin e表达增高，随着乳腺癌的分期、分级的增加，cyclin e表达逐渐增高。在进一步的研究中发现，cyclin e相关激酶活性在肿瘤组织明显高于正常组织，而在复发性白血病中cyclin e的表达较初发时高［13］，这表明表达水平反映疾病的进展。
我们对经干扰素α 2 000 u/l （ic50）处理的细胞周期蛋白cyclin e应用rtpcr方法检测结果显示,在未用干扰素α处理的细胞中，cyclin e表达明显增高，但随着作用时间的延长cyclin e的表达明显下调，有明显的时间依赖性。这和lida等［14］研究的结果类似，提示cyclin e的异常表达可能是白血病细胞发生、发展过程中的重要事件之一。cyclin e在白血病细胞中的异常表达的机制还未完全阐明,可能与基因扩增和转录后的调控机制失常有关。keyomarsi等［15］认为，cyclin e的过度表达可以缩短g1期时间或加速g1期的进程,甚至可使细胞突破检测点的检测而直接进入s期,降低对丝裂原的依赖性,并使分裂细胞形态异常,细胞体积变小,最终导致细胞周期调节紊乱,细胞增殖失控。
总之，本实验结果显示，干扰素α对体外白血病细胞u937细胞有明显的抗增殖和诱导凋亡作用,降低细胞周期蛋白cyclin e的表达，进一步验证了干扰素α抗肿瘤活性与浓度、剂量和时间密切相关。这可能是干扰素α体外抗白血病作用的重要机制之一, 为临床上干扰素α用于治疗白血病,提供一个有力的证据。
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