【摘要】 本研究探讨存活蛋白（survivin）和p63蛋白在b细胞非霍奇金淋巴瘤（bnhl）发生发展中的可能作用及其与细胞凋亡和增殖的相互关系。 应用免疫组织化学sp法和tdt介导的dutp缺口末端标记（tunel）技术检测43例bnhl和10例反应性增殖淋巴组织（rhl）中的survivin和p63蛋白表达以及细胞凋亡和增殖细胞核抗原（pcna）的水平。 结果表明： survivin和p63在43例bnhl中表达的阳性率分别为69.8%（30/43）和82.7%（36/43），survivin和 p63在10例rhl中表达阳性率分别为10%（1/10）和 40%（4/10），survivin在侵袭性bnhl中的阳性率明显高于惰性bnhl（83.3% vs 46.2%，p<0.01），p63蛋白表达差异无显著性意义；survivin阳性表达与凋亡指数（ai）和增殖指数（pi）呈正相关（r=0.429, p<0.01; r=0.348, p<0.01），p63蛋白阳性表达与ai和pi呈正相关（r=0.451, p<0.01; r=0.369, p<0.05），bnhl的ai和pi呈显著正相关（r=0.598, p<0.001）。 结论： survivin可能参与了bnhl的凋亡和增殖调控机制，p63作为癌基因参与bnhl发生，二者可能共同影响细胞增殖和凋亡。
【关键词】 b细胞非霍奇金淋巴瘤 survivin p63蛋白 细胞增殖
expression of survivin and p63 protein in b cell nonhodgkin′s lymphoma and their effects on cell apoptosis and proliferation
zuo xuelan,zhou ying,zhou xin1, liu xiaohong,zhang kejian,yang huaqiang,meng juan
department of hematology, 1gene detection center, zhongnan hospital, wuhan university, wuhan 430071, china
abstract the study was aimed to explore the possible roles of survivin and p63 protein in the development and progression of b cell nonhodgkin′s lymphoma (bnhl) and their relation with cell apoptosis and proliferation. tdtmediated dutp nick end labeling (tunel) and immunohistochemistry were used to detect the survivin and p63 protein expression, cell apoptosis and proliferating cell nuclear antigen (pcna) level in 43 cases of bnhl and 10 cases of reactive hyperplasia lymphoid (rhl) tissues. the results indicated that the positive rates of survivin and p63 protein expression were 69.8% (30/43) and 82.7% (30/43) respectively. the expression of survivin and p63 protein was 10%( 1/10) and 40% (4/10) in rhl tissues of 10 cases. the expression of survivin in aggression bnhl was higher than that in indolent bnhl (83.3% vs 46.2%, p<0.01). the expression of p63 proteins in aggressive bnhl was higher than that in indolent bnhl (86.7% vs 76.9%, p>0.05). apoptotic index (ai) and proliferation index (pi) correlated positively with expression of survivin (r=0.429, p <0.01; r=0.348, p<0.01), and so do with expression of p63 proteins (r=0.451, p <0.01; r=0.369, p<0.05). in addition, ai and pi were positively related (r=0.598, p<0.001). it is concluded that survivin may participate in the regulation mechanism of bnhl cell apoptosis and proliferation, p63 as an oncogene enhances proliferation and takes part in the development of bnhl. there may be a close relationship between survivin and p63 protein in the regulation of lymphocyte proliferative kinetics.
key words b cell nonhodgkin′ s lymphoma; survivin; p63 proteins; cell apoptosis; cell proliferation
j exp hematol 2007; 15(1):99-102
存活蛋白（survivin）是近年来新发现的一种凋亡抑制蛋白，属于凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，iap）成员之一［1］。wWW.11665.com我们利用tdt介导的dutp缺口末端标记（tunel）技术检测bnhl中的凋亡细胞;同时，利用免疫组织化学sp法检测survivin和p63蛋白在43例b细胞非霍奇金淋巴瘤（bnhl）和10例反应性增殖淋巴组织（rhl）中的表达及二者的分布特点，结合增殖细胞核抗原（pcna）的表达，研究bnhl中 survivin、p63蛋白的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系;分析它们与bnhl 恶性程度的关系;探讨二者在bnhl发生、发展中的作用及相互关系。
对象
bnhl患者来自2000年1月至2004年12月武汉市多家医院，43例中男28例，女15例，中位年龄48（3-78）岁。43例bnhl中淋巴结内病变35例（81.4%），结外病变8例（18.6%）。10例反应性增殖淋巴结作为对照组。所有bnhl患者取材前未经任何放疗或化疗。
病理切片及分类
常规病理切片、固定、染色、抗体标记淋巴细胞亚群，进行免疫分型;由两位病理学专家重新阅片并参照2000年who诊断标准进行病理组织学分类分级。43例中小淋巴细胞性淋巴瘤（sll/cll）5例,滤泡性淋巴瘤(fl)2例,黏膜相关淋巴组织边缘区b细胞淋巴瘤（malt）7例，弥漫大b细胞淋巴瘤（dlbl）27例，淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤（mzl）1例，浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤（pcm/pcl）1例。惰性bnhl 13例（30.2%），侵袭性bnhl 30例（69.8%）。
免疫组织化学染色及结果判定
采用链霉素抗生物素过氧化酶（sp）法超敏试剂盒（福州迈新生物技术有限公司产品）检测survivin、p63、pcna的表达。dab、pbs、枸橼酸盐酸等均购自福州迈新生物技术有限公司；操作按说明书进行，4 μm石蜡切片进行免疫组织化学染色。以pbs替代一抗作阴性对照。增殖指数（proliferation index, pi）的计算：高倍视野下计数1 000个肿瘤细胞中pcna阳性细胞数所占百分比为pi，对滤泡性nhl只计数滤泡内的肿瘤细胞。survivin阳性表达于细胞浆，p63蛋白阳性表达于细胞核。在高倍镜下选10个具有代表性视野，计算1 000个肿瘤细胞中阳性细胞数并换算成百分比。阴性（-）：阳性细胞数<5%；弱阳性（+）：阳性细胞数介于5%-25%；中度阳性（++）：阳性细胞数介于25%-50%；强阳性（+++ ）：阳性细胞数大于50%。
细胞凋亡tunel检测
采用tunel试剂（roche公司产品）检测凋亡细胞，参照roche公司原位末端标记试剂操作手册及文献进行。凋亡指数（apoptotic index, ai）的计算：每张切片在放大400倍镜下随机读取1 000个细胞(不含坏死组织的视野)。公式为：
阳性细胞率(%) =(阳性细胞数/总细胞数)×100%。
统计学分析
survivin和p63在bnhl各亚型的表达和恶性程度的关系采用ridit分析，χ2检验、spearman rank相关分析采用ssps 11.5软件统计。
结 果
survivin、p63蛋白在反应性增殖淋巴结中的表达
在反应性增殖淋巴结中survivin表达基本上呈阴性表达，10%（1/10）出现阳性表达，阳性细胞数少,胞浆中棕黄色淡染。p63表达的阳性率为40%（4/10），阳性细胞数少和核着色强度低，阳性细胞散在分布于淋巴滤泡生发中心的中心细胞，套区细胞很少表达。
survivin、p63蛋白在bnhl中的表达
survivin和p63蛋白在bnhl标本中表达的总阳性率分别为69.8%（30/43）和82.7%（36/43）。各种类型bnhl survivin和p63的表达强度显示如下：survivin阳性表达主要位于细胞浆，少数同时有核表达，dlbl 的阳性率为81.48%,强阳性表达占44.44%，sll/cll、malt、fl、mzl、pcm/pcl呈低表达或不表达；survivin在惰性淋巴瘤组的表达率为46.2%（6/13），明显低于侵袭性淋巴瘤组的表达率83.3%（24/30），两组间有显著性差异（p<0.05）(表1)。p63蛋白阳性表达于细胞核，阳性细胞弥散分布于肿瘤细胞附近，而周围反应性淋巴细胞为阴性。p63 在dlbl 的阳性率为92.59%,强阳性表达占55.55%，2例fl均呈低表达，sll/cll、malt、mzl、pcm/pcl呈低表达或不表达；p63在惰性淋巴瘤的表达率为76.9%（10/13）低于侵袭性淋巴瘤组的表达率86.7%（26/30），两组间无显著性差异（p>0.05）（表2）。
bnhl细胞凋亡和增殖的关系
43份bnhl标本中的ai中位数为1.62%，pcna的阳性率为100%。pi的中位数为43.4%。经spearman等级相关分析证实两者间呈显著性正相关（r=0.598, p<0.001）。经mamnwhitney u检验，ai和pi与bnhl的恶性度有关，侵袭性bnhl组的ai和pi均显著增高，与惰性bnhl组相比有显著性意义（p<0.01）（表3）。table 1. expression intensity of survivin in b cell nonhodgkin′ s lymphoma and ridit analysis
survivin、p63的表达与ai、pi的关系
经marnwhitney u检验，survivin的表达与ai和pi关系密切，survivin表达阳性组ai和pi显著高于阴性组（p<0.01）。p63蛋白的表达与ai和pi关系密切，p63蛋白表达阳性组ai和pi高于阴性组（p<0.05）。经spearman等级相关分析，survivin的表达与ai和pi呈显著正相关（r=0.429, p<0.01; r=0.348, p<0.01），p63的表达与ai和pi也呈正相关（r=0.451, p<0.01; r=0.369, p<0.05）(表4)。
讨 论
survivin 是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins, iap）家族的新成员，1997年耶鲁大学altieri等用效应蛋白酶受体21（effectors cell protease receptor 21，epr21）cdna在人类基因库的杂交筛选中分离出来［1］，它是一个含142个氨基酸的蛋白，基因定位于人染色体17q25，长度范围75-130 kb，分别由不同的mrna(1.9 kb和1.3 kb)所编码［2］。研究发现，survivin 的表达具有细胞周期依赖性，在细胞周期g2/m期表达，促进细胞增殖，通过抑制细胞凋亡参与细胞凋亡调控。其作用机制在于直接抑制caspase 3和caspase 7蛋白酶来阻止细胞凋亡［1］。目前对于它在淋巴细胞及淋巴系肿瘤细胞中的表达特点及临床意义尚不十分清楚。为此，我们从蛋白表达水平上初步检测了良、恶性淋巴组织中survivin的表达和分布。结果显示，在反应性增殖淋巴结（rhl）中survivin不表达或很少表达，在fl，sll/cll，malt、mzl和pcl的低凋亡率的肿瘤细胞中常不表达和或表达减弱，本组结果与文献报告基本一致［3-6］。在侵袭性 bnhl组的survivin蛋白表达为83.3%，显著高于惰性bnhl组。以上的表达分布特征可能与细胞凋亡作用相关。进一步研究survivin与肿瘤细胞凋亡和增殖的关系的结果表明， survivin阳性表达组ai和pi显著高于survivin阴性表达组。 survivin 表达与ai和pi及bnhl恶性度之间的平行关系，这提示survivin可能参与了bnhl的细胞凋亡调节机制，其表达强度可能与肿瘤恶性度和细胞凋亡特性有密切关系，同时发现survivin有促进bnhl瘤细胞增殖的作用，但促进其增殖的调控机制尚不清楚，可能是survivin与cdk4直接作用，导致cdk2 /cy2clin e 激活与rb磷酸化，磷酸化的rb蛋白失去对细胞生长的抑制作用,导致细胞失控性增长［7］。
p63蛋白的基因结构与p53 基因具有高度的同源性,是p53家族的新成员,该基因定位于3q27-3q29,编码两类转录产物［8］。p63 高表达于许多组织的上皮基底层与生发层,也表达于起源这些部位的肿瘤组织,对于各种上皮组织的正常发育、分化及形态发生只有重要的作用［9］。目前，p63在nhl的表达只有少数报道。我们检测了p63在良性和恶性淋巴组织的表达，结果显示p63 在rhl的表达率为40%，阳性细胞分布于淋巴滤泡生发中心的中心细胞，套区很少表达；p63 在bnhl的表达率为82.7%， p63 在侵袭性bnhl的表达高于惰性bnhl，但无统计学意义。探讨bnhl与 ai和pi关系时发现，p63的表达与ai和pi密切相关，p63 表达阳性组的ai和pi高于p63蛋白阴性组，有统计学意义。近年研究表明，缺指/趾畸形外胚层发育不良裂口三联综合症（eec3综合症）患者发展为dlbl是与p63 基因密切相关，推测p63 蛋白发挥了功能性抑癌基因作用［10］。hu等［11］证实p63促进细胞的分化和增殖，并促进肿瘤的发生。我们结果证明，p63在bnhl瘤细胞过度表达，可能影响细胞增殖和凋亡并参与了肿瘤的发生，这一结果支持p63在肿瘤的发生与发展中扮演着癌基因而不是抑癌基因的角色。
关于bnhl的细胞凋亡与增殖之间的研究较少，本组资料显示，43例bnhl细胞ai与pi呈正相关。推测可能与同一肿瘤中不同细胞克隆亚群之间相互竞争而发生的选择机制有关。部分低增殖或处于增殖末期肿瘤细胞受到高增殖肿瘤细胞诱导发生凋亡，使后者获得更好增殖条件，促使整个肿瘤快速增长。survivin和p63可能参与bnhl的凋亡和增殖，这为进一步探索bnhl的发生、发展提供了新的依据。
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