【摘要】 【目的】 探讨白细胞介素17(il-17)、干扰素γ(ifn-γ)在不同类型慢性中耳炎(com)中的表达水平及与骨质破坏的关系。【方法】 用免疫组织化学的方法检测了实验组37例慢性中耳炎病变组织(胆脂瘤中耳炎20例，非胆脂瘤中耳炎17例)和对照组18例(13例正常外耳道皮肤及5例正常中耳黏膜)中的il-17、ifn-γ的表达。【结果】 il-17在胆脂瘤中耳炎、非胆脂瘤中耳炎、外耳道皮肤及中耳黏膜中的阳性表达指数分别为(81.6 ± 20.0)%、(43.3 ± 25.7)%、(4.7 ± 1.9)%和(5.6 ± 2.3)%，实验组与对照组比较差异有统计学意义(p < 0.001);ifn-γ在胆脂瘤中耳炎、非胆脂瘤中耳炎、外耳道皮肤及中耳黏膜的阳性表达指数分别为(65.4 ± 24.0)%、(30.1 ± 24.5)%、(4.8 ± 1.8)%和(4.0 ± 1.6)%，实验组与对照组差异有统计学意义(p < 0.001);慢性中耳炎病变组织中il-17(r = 0.685，p < 0.001)、ifn-γ(r = 0.662，p < 0.001)与骨质破坏程度均成正相关。【结论】 慢性中耳炎患者病变组织中的il-17、ifn-γ表达水平的上调可能与该病骨质破坏的发生有关。
【关键词】 il-17; ifn-γ; 慢性中耳炎; 骨质破坏; 破骨细胞
abstract： 【objective】 to investigate the expression levels of interleukin-17 (il-17) and in interferon-gamma (ifn-γ) in biopsies of the patients with different types of chronic otitis media (com) and its relationship with bone resorption. 【methods】 the biopsies were collected from 37 cases of chronic otitis media (20 cases of cholesteatoma， 17 cases of non cholesteatoma) and 18 controls (13 cases of external auditory canal epithelium， 5 cases of middle ear mucosa). the expression of il-17 and ifn-γ were analyzed with immunohistochemistry in pathologic tissue and controls. 【results】 the expression levels of il-17 were (81.6 ± 20.0)%， (43.3 ± 25.7)%， (4.7 ± 1.9)%， and (5.6 ± 2.3)% in cholesteatoma， granulation， external auditory canal epithelium and middle ear mucosa respectively. the experimental group and control group statistically significant difference (p < 0.001). the expression levels of ifn-γ were (65.4 ± 24.0)%， (30.1 ± 24.5)%， (4.8 ± 1.8)%， and (4.0 ± 1.6)% in cholesteatoma， granulation， external auditory canal epithelium and middle ear mucosa respectively. the experimental group and control group showed statistically significant difference (p < 0.001). 【conclusion】 the results indicate that up-regulated expression of il-17 and ifn-γ might be related to the bone resorption of chronic otitis media.
慢性中耳炎(chronic otitis media， com)是常见的中耳炎性疾病，目前主要将其分为胆脂瘤型中耳炎及非胆脂瘤型中耳炎两型。WwW.11665.COM骨质破坏是它们的基本病理特征之一，流行病学调查显示胆脂瘤型中耳炎骨质破坏的发生率为80%，而在非胆脂瘤型中耳炎中也达到了10% ～ 20%的发病率[1]。然而目前关于骨质破坏发生的确切机制仍不清楚，近几年的研究发现慢性中耳炎患者的局部病灶中有大量的炎性细胞侵润，这些炎性细胞及其分泌的细胞因子参与调节了破骨细胞的活化，而后者被认为可能是中耳炎性疾病骨质破坏的最终效应细胞。因此，有学者推断慢性中耳炎的骨质破坏与局部病灶中的各种炎症细胞及因子有密切关系[2-4]。白细胞介素17(interleukin17，il-17)、干扰素γ(interferonγ，ifn-γ)分别是th17、th1的标志性细胞因子，它们在机体免疫应答中起到关键作用，具有多种免疫活性，不仅可以作为强大的前炎症因子激活局部的炎症反应，还可以调节破骨细胞的生成而影响骨质吸收。但目前有关于il-17、ifn-γ与慢性中耳炎的研究相对较少，因此，本研究通过观察il-17、ifn-γ在不同类型慢性中耳炎中的表达特点，试图探讨它们与骨质破坏的相关性。
1 材料与方法
1.1 病例资料
实验组37例，为2008年7月-2009年5月在中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院行改良乳突根治术并鼓室成形术并符合纳入标准的慢性中耳炎患者，年龄18 ～ 66岁，病程10个月 ～ 40年，男24例，女13例;分为胆脂瘤组20例和非胆脂瘤组17例，其中胆脂瘤组的研究标本为胆脂瘤型中耳炎的胆脂瘤和上皮下基质组织，非胆脂瘤组为骨疡型中耳炎的肉芽组织，对照组为13例外耳道上皮标本(从上述37例患者随机获取)及5例正常中耳黏膜组织(从颞骨外伤骨质患者行面神经减压术中获取);全部标本均经过术后常规病理活检得到证实。所有受检者实验前2周内均未全身或局部使用糖皮质激素及免疫抑制剂。
1.2 实验方法
兔抗人il-17、ifn-γ多克隆igg抗体均购自santa cruz公司，envision法免疫组织化学试剂盒和dab显色盒购自北京中杉生物公司。 将石蜡包埋的标本4 μm厚连续切片，常规脱蜡水化后，用30 ml/l过氧化氢甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶活性;0.01 mol/l柠檬酸盐缓冲液(ph 6.0)95 ℃加热，抗原修复;滴加一抗(il-17、ifn-γ多克隆兔igg抗体)，工作浓度为1 ∶ 100;4 ℃过夜;滴加第二抗体，37 ℃孵育30 min; dab显色，苏木精复染，中性树胶封片，显微镜下观察，用pbs代替一抗做阴性对照。
阳性结果判定：阳性染色呈棕黄色，观察其在各组标本中表达的分布特点及其在细胞内的表达部位。高倍镜(400倍)下每张切片随机选取5个视野， 计数每个视野内细胞总数(n)及阳性染色细胞数(n)，并计算出每例单位视野内细胞总数(∑n)及阳性细胞总数(∑n)，求出每例标本的阳性指数(pi)，应用公式pi = ∑n/∑n × 100%，取各视野阳性细胞表达的平均数作为阳性细胞表达率[5]。采用双盲法观察，由中山大学附属第一医院病理科两位技术员分别进行。
1.3 骨质破坏程度分级
以手术术中高倍显微镜下所见及影象学资料对37例患者进行判断分为3级：轻度，盾板和单个听小骨破坏;中度，两个或两个以上听小骨和鼓室盖、乳突盖的破坏;重度，听小骨的完全性破坏和骨迷路、外耳道后壁以及面神经骨管的破坏[6]。所有资料与2008年7月-2009年5月在中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院获取。
1.4 统计学处理
数据以均数 ± 标准差表示，采用mann-whitney test、kruskal-wallis test和spearman correlation test进行数据分析，检验水准取α = 0.05。
2 结 果
2.1 il-17的表达情况
il-17阳性表达定位于细胞质内，呈棕黄色，部分细胞核着色，20例胆脂瘤组织标本和17例非胆脂瘤肉芽组织中均有表达，呈不同程度的高、中、弱表达。胆脂瘤组织标本中il-17阳性表达细胞分布于胆脂瘤上皮下基质中，多为浸润的炎性细胞，细胞质丰富，在肉芽组织中il-17阳性表达细胞为侵润的炎性细胞，两者il-17的阳性指数(pi)均值分别为(81.6 ± 20.0)%和(43.3 ± 25.7)%，与非胆脂瘤组肉芽组织相比，il-17在胆脂瘤组织中的表达明显增加(p = 0.001)。13例外耳道皮肤标本中几乎没有il-17阳性表达，仅在皮下组织中有散在几个含有棕黄色颗粒的细胞，pi为(4.7 ± 1.9)%。il-17在胆脂瘤组织中的表达明显高于对照组(p < 0.001); il-17在非胆脂瘤组肉芽组织中的表达亦高于对照组(p < 0.001); 3组比较差异有统计学意义(p < 0.001);il-17在中耳黏膜的pi为(5.6 ± 2.3)%，与胆脂瘤组织(p < 0.001)及非胆脂瘤组织(p < 0.001)相比，表达明显减少;与外耳道皮肤组织相比，表达量无明显差异(p > 0.05;图1及图2)。
2.2 ifn-γ的表达情况
ifn-γ阳性表达定位于细胞质内，呈棕黄色，部分细胞核着色， 20例胆脂瘤组织标本和17例非胆脂瘤组肉芽组织中均有表达，呈不同程度的高、中、弱表达。胆脂瘤组织标本中ifn-γ阳性表达细胞分布于胆脂瘤上皮下基质中，多为浸润的炎性细胞，细胞质丰富，在肉芽组织中ifn-γ阳性表达细胞为侵润的炎性细胞，两者ifn-γ的阳性指数(pi)均值分别为(65.4 ± 24.0)%和(30.1 ± 24.5)%，与非胆脂瘤组肉芽组织相比，ifn-γ在胆脂瘤组织中的表达明显增加(p = 0.002)。13例外耳道皮肤标本中几乎没有ifn-γ阳性表达，仅在皮下组织中有散在几个含有棕黄色颗粒的细胞，pi为(4.8 ± 1.8)%。ifn-γ在胆脂瘤组织中的表达明显高于对照组(p < 0.001); ifn-γ在非胆脂瘤组肉芽组织中的表达亦高于对照组(p < 0.001); 三组比较差异有统计学意义(p < 0.001);il-17在中耳黏膜的pi为(4.0 ± 1.6)%，与胆脂瘤组织(p < 0.001)及非胆脂瘤组织(p < 0.001)相比，表达明显减少;与外耳道皮肤组织相比，表达量无明显差异(p > 0.05;图1及图2)。
2.3 il-17、ifn-γ与骨质破坏程度的相关性
对不同类型慢性中耳炎病灶中的il-17、ifn-γ相对表达量与骨质破坏程度间的关系进行分析，详见表1、表2。结果显示在每一实验组，骨质破坏程度不同级别下的il-17、ifn-γ的阳性指数之间差异有统计学意义(p < 0.05;图3)，两两比较发现不同级别之间差异均有统计学意义(p < 0.05);进一步行spearman等级相关分析，结果显示il-17(r = 0.685，p < 0.001)、ifn-γ(r = 0.662，p < 0.001)与骨质破坏程度密切相关，随着il-17、ifn-γ相对表达量的增加，骨质破坏程度也随着加重。
3 讨 论
hofbauer等[7]提出关于细胞因子对破骨细胞调控的收敛假说，认为大多数上游细胞因子和激素最终都是通过对opg/rank/rank的调控而影响活性破骨细胞池的大小。一旦一个或多个上游因子的变化，将导致rankl与opg平衡破坏，从而引起骨质代谢的紊乱[8]。在慢性中耳炎骨质破坏机制的研究中，也发现诸多细胞因子参与其中，如akimoto等[9]发现在胆脂瘤中tnf-α表达明显增高，且广泛性骨质破坏的胆脂瘤中tnf-α含量明显高于局限性骨质破坏的胆脂瘤;marenda等[10-11]研究显示il-6在中耳胆脂瘤表达上调，且表达量与听小骨链的破坏的关系极为显著，但关于这些细胞因子是通过何种途径调控opg/rank/rank系统尚不明确。
3.1 il-17与慢性中耳炎骨质破坏的关系
随着骨免疫学的发展，人们发现，t淋巴细胞及其分泌的细胞因子对于破骨细胞的调控及骨质破坏的启动有重要作用。kotake等[12]证实il-17可以通过调节破骨细胞前体及成骨细胞间的相互作用来激活破骨细胞的成熟，il-17首先作用于成骨细胞，通过刺激cox-2促进peg2的合成，进而诱导rankl基因的表达，打破rankl与opg之间的平衡，启动骨质破坏。另一方面，il-17是th17参与免疫应答的主要效应因子，在疾病发展的各个阶段，il-17发挥其强大的前炎症因子作用，诱导多种细胞因子的表达。如kuligowska等[13]发现il-17以时间和剂量依赖方式诱导il-1和tnf-α分泌;还有学者等[14]报道il-17可以诱导基质金属蛋白酶9的表达，而这些下游因子在骨质破坏发生的不同阶段发挥作用。以上研究结果表明il-17是诱导骨质破坏的关键因子。目前关于il-17与慢性中耳炎的研究尚属空白，顾之燕等[15]指出慢性中耳炎是由t淋巴细胞介导的慢性炎症反应，t细胞及其细胞因子在慢性中耳炎的发病过程中起到了重要作用。结合本研究结果：il-17在慢性中耳炎中的胆脂瘤组织和肉芽组织中均有不同程度的表达，与正常外耳道皮肤比较，表达显著上调; 而且il-17(r = 0.685， p < 0.001)的阳性表达细胞数和骨质破坏的程度成正相关。我们推断il-17可能是引起慢性中耳炎骨质破坏的关键因子，它作为上游调控因子，一方面直接影响rankl与opg之间的平衡，另一方面促进其他细胞因子的表达，间接影响骨质破坏的发生。
3.2 ifn-γ与慢性中耳炎骨质破坏的关系
ifn-γ作为th1的标志性细胞因子，对于破骨细胞的调控一直存在争议。takayanagi等[16]报道在体外实验中，ifn-γ可以通过快速降解rank的衔接蛋白-traf6来干扰rankl的信号在细胞内的传导，并且拮抗il-17的作用来抑制破骨细胞的形成。而gao等[17]在活体研究中发现ifn-γ是破骨细胞形成的潜在刺激剂，它可以上调mhc-ⅱ抗原的表达，进而促进t细胞的活化与增殖。而活化的t细胞可以产生大量的rankl和tnf-α等。他们认为在活体内， ifn-γ这种间接的促进作用已经远远超过其对破骨细胞前体的抑制作用，最终导致破骨细胞的形成，出现骨质破坏。本研究结果发现ifn-γ在慢性中耳炎中的胆脂瘤组织和肉芽组织中均有表达，与正常外耳道皮肤比较，差异有统计学意义，且ifn-γ的阳性表达细胞数和骨质破坏的程度成正相关(r = 0.662，p < 0.001)。沈志忠等[18]用流式细胞分析技术对胆脂瘤中耳炎患者外周血中ifn-γ的表达进行检测，结果与本研究相似，表明ifn-γ在慢性中耳炎骨质破坏中起到了促进作用。
3.3 本研究的局限性
目前已证实破骨细胞是慢性中耳炎骨质破坏的最终作用细胞，诸多细胞因子参与了破骨细胞的活化，它们相互促进，相互拮抗，形成一个复杂的网络通路。本研究结果表明慢性中耳炎病变局部的il-17、ifn-γ可能作为关键的上游调控因子参与骨质破坏的发生，为进一步完善该网络通路做了一些基础工作。但chole等[19]通过研究发现在临床胆脂瘤标本中有活性的破骨细胞罕见，而在实验性胆脂瘤中却可见大量活性破骨细胞和破骨细胞前体细胞的存在。本文亦未从破骨细胞的数量及活化程度与两种因子进行相关性分析，其主要原因主要有以下几点[20]：①常规的实验方式包括电镜和光镜的取材、观察范围有限，无法检测出破骨细胞。本课题组通过前期实验发现，对75例胆脂瘤标本、63例慢性中耳炎肉芽组织及破坏的听小骨进行he染色后，光镜下观察，仅发现2例胆脂瘤标本中有破骨细胞。②破骨细胞作为一种瞬时细胞其生命周期相对较短，所以虽然观察到骨质破坏，但在进行组织取材固定过程中，可能破骨细胞已经出现凋亡。③中耳胆脂瘤疾病过程包括急性及平稳期，在疾病急性期所固定的标本，则可能检测到破骨细胞，反之则检测不到。④标本来源于需要手术的病人，这些病人多数已经过药物的保守治疗，这些药物会抑制破骨细胞。所以要直接检测破骨细胞的数量及活性，在技术方面和病例选择方面有一定难度。本实验虽未直接表明il-17、ifn-γ与破骨细胞的关系，但是通过分析两种因子和骨质破坏程度呈正比，再结合il-17、ifn-γ的生物学活性，能间接地从一定程度上说明两种因子在中耳胆脂瘤中可能是通过调控破骨细胞的活性来参与骨质破坏的形成。进一步研究应对一些相关影响因素进行严格限制(如加大标本量，严格区分患者有无治疗，采用敏感性高的检测方法等)。
3.4 小 结
总之，实验结果表明il-17、ifn-γ参与了中耳胆脂瘤疾病的发生发展，在骨质破坏的形成过程中起到了重要的作用。因此我们可以推测在中耳胆脂瘤的保守治疗中以il-17、ifn-γ为靶点，阻断两者的作用，对减缓疾病的发展和并发症的发生、减小手术风险和难度、改善预后并提高患者的生活质量有一定的临床意义。但目前有关il-17、ifn-γ与慢性中耳炎的研究相对较少，本研究也仅仅从蛋白质水平对il-17、ifn-γ在慢性中耳炎中的表达进行了粗浅的探讨，要确切了解il-17、ifn-γ在慢性中耳炎骨质破坏中的具体作用及两者间相互调控的机理，尚有待于更深入的研究。
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