摘要】 目的：针对小鼠骨髓树突状细胞（dc）髓性分化因子88（myd88），采用rna干扰技术抑制其合成，观察脂多糖（lps）刺激后dc生物学活性的变化，探讨获得耐受性dc的方法，为dc的临床应用提供新思路和理论依据。方法：培养小鼠骨髓源性dc，分为对照组、lps组及rna干扰组，对照组不予任何处理，lps组加入终浓度为1 μg/ml的lps, rna干扰组于加入myd88 sirna 12小时后给予1 μg/ml lps刺激，继续培养3天。免疫细胞化学检测dc myd88、核因子κb（nfκb）的表达，western blot检测dc myd88的表达；流式细胞术检测dc细胞表面cd80、cd86及mhcⅱ分子的变化，elisa法检测各组dc分泌tnfα。ifnγ和il12的浓度，混合淋巴细胞培养检测t细胞增殖能力。结果：lps促进dc高表达cd80、cd86及mhcⅱ分子，促进th1型细胞因子释放、myd88高表达及nfκb核移位，并诱导t细胞增殖，myd88 sirna可阻断lps的这些效应。结论：myd88 sirna可抑制dc成熟，产生耐受性dc，增强同种未成熟dc的免疫耐受诱导作用，为进一步研究dc的临床应用奠定了基础。
【关键词】 树突状细胞 myd88 rna干扰 脂多糖
inhibition effect of myd88 sirna to the activation of dendritic cells from murine bone marrow
chen jiajun, sun zongquan, su gang, liu chao, liu jinping, deng yongzhi, shi jiawei.
department of cardiovascular surgery, union hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430022, china
［abstract］objective:to observe the impact of myeloid differentiaion factor 88(myd88) sirna on the biological activities of dendritic cells(dcs) cultured from murine bone marrow under stimulation by lipopolysaccharides(lps), and provide novel ideas and basis of dc’s clinical applications.methods:mouse dcs were generated from bone marrow cells and were divided into control group, lps group and rna interference group. control group was added nothing, and lps group was added lps at the final concentration of 1 μg/ml. myd88 sirna was added in rna interference group, and 12 hours later lps at the final concentration of 10 μg/ml was added. all groups were cultured for 3 days thereafter. immunochemistry was used to detect the concentration of myd88 and nfκb. western blot was used to detect the concentration of myd88. flow cytometry and mixed lymphocyte reaction(mlr) was used to detect the phenotypes and functional properties of dcs. elisa was used to detect the concentration of tnfα, ifnγ and il12 in the supernatant.results:lps stimulation increased the cd80, cd86, mhcⅱ on the membrane of dcs and tnfα, ifnγ, il12 concentration in the supernatant. lps stimulation also increased the myd88 in the cytoplasm and promoted translocation of nfκb to karyon. myd88 sirna can inhibit all these responess.conclusion:myd88 sirna can suppress maturation of dcs and promote the toleranceinduction effect of dcs.
［key words］dendritic cells；myd88；rna interference；lipopolysaccharides
树突状细胞(dendritic cell，dc)是体内功能最强的抗原提呈细胞，其功能与成熟状态密切相关，具有激发免疫应答和诱导免疫耐受的双重作用，参与炎症、肿瘤、自身免疫性疾病及移植排斥反应等多种病理生理过程。wwW.11665.Com利用dc具有诱导t细胞免疫耐受的特性，构建耐受性dc用于治疗自身免疫性疾病目前研究表明，toll样受体及其信号途径在调控dc成熟过程中起重要作用，阻断toll 样受体信号途径是有效获取耐受性dc的方法之一［2］。髓性分化因子88（myd88）是toll样受体信号途径中重要的衔接分子，其功能缺陷可导致信号传导中断。本实验应用rna干扰技术抑制myd88合成，观察小鼠骨髓dc生物学活性的变化，以期获得耐受性dc，为dc的临床应用提供新思路和理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
近交系balb/c小鼠和c57雄性小鼠，6～10周龄，购自华中科技大学同济医学院器官移植研究所；10%fcs和rmpi1640培养液（gibco公司）；重组小鼠gmcsf（rmgmcsf，peprotech公司）；lps(invivogen公司)；fitc标记的抗小鼠cd80及cd86购自biolegend公司；fitc标记的抗小鼠mhcⅱ类分子抗体（antimouse iad）购自pharmingen公司；小鼠细胞因子定量检测elisa试剂盒购自晶美公司；抗小鼠nfκb/p65抗体及myd88抗体购自lab vision公司；myd88 sirna、rnaimate为上海吉玛制药公司产品。
1.2 小鼠骨髓源性dc 的分离和培养
无菌条件下取balb/c小鼠双侧股骨、胫骨和肱骨，用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗骨髓腔制备骨髓悬液，红细胞裂解液去除红细胞后，用rpmi1640全培养液配成2×106 ml-1的细胞悬液，分至6孔细胞培养板中，加入gmcsf 20 ng/ml，每3天半量换液，并补充等剂量的gmcsf。8天时dc纯度可达80%以上，此时收集细胞，用pbs洗涤后分为三组，①对照组：培养过程中不加lps及myd88 sirna；②lps组：加入终浓度为1 μg/ml的lps；③rna干扰组：加入myd88 sirna 12小时后给予1 μg/ml lps刺激。三组细胞继续培养3天。
1.3 myd88 sirna转染方法
于500 μl的无血清培养基中稀释5 μg sirna，加入15 μg rnaimate试剂，温育30分钟使复合物形成；将上述体系加入含dc的6孔板中，终体积为2 ml，细胞继续培养3天，荧光显微镜检测转染效率。
1.4 myd88、nfκb的免疫细胞化学检测
参照文献［3］的方法，检测各组dc myd88、nfκb的表达。
1.5 western blot检测dc myd88的含量
参照《分子克隆》的实验方法，包括蛋白提取、电泳、转印、杂交及显色，以面积×灰度值表示myd88的含量，计算各组与对照组的比值。
1.6 流式细胞仪(facs)鉴定dc表面标志
将5×105个dc悬于100 μl pbs，加入fitc标记的各种单克隆抗体0.5 μl，4℃避光孵育30分钟，离心弃上清，加入1 ml pbs清洗细胞1次，然后将细胞重悬于0.5 ml pbs避光置于4℃，流式细胞仪(bd公司)检测，cellquest软件分析。
1.7 dc产生细胞因子的检测
收集培养3天的各组dc上清，按elisa试剂盒说明操作，每组设3复孔，检测细胞因子含量。
1.8 混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，mlr）
取c57小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用淋巴细胞分层液离心获得单个核细胞，尼龙毛刷法去除粘附细胞，获得同种异体t细胞作为反应细胞。rpmi1640培养液重悬培养获得的dc，加入终浓度为25 ng/ml的丝裂霉素c，37℃孵育45分钟，按照刺激细胞∶反应细胞分别为1∶100、1∶25和1∶10的比例，将dc和t细胞置于96孔板混合培养，其中每孔t细胞数为5×105个，终体积为200 μl。每组设3个复孔，设单纯t细胞组为对照组，另设空白对照孔。于37℃、5%co2条件下培养3天，第3天时加入20 μl mtt，继续避光孵育2～4小时，离心去除培养液，加入100 μl dmso溶解细胞，避光放置2小时，用酶标仪测a570值，取3孔的平均值作为结果，计算刺激指数（si）。
si=实验组a值-空白孔a值对照组a值-空白孔a值。
1.9 统计学分析
所有实验数据均重复3次。结果以x±s表示。资料分析采用spss 10.0统计软件中oneway anova法统计。
2 结果
2.1 myd88 sirna对dc表达myd88、nfκb的影响
免疫细胞化学检测提示myd88位于胞浆中， rna干扰组及对照组myd88染色示阳性信号较弱，呈浅黄色；lps组染色示阳性信号增强，呈深棕黄色；rna干扰组及对照组nfκb的表达主要位于胞浆，lps组可见明显nfκb移位于细胞核内，见图1～图4。
2.2 western blot检测dc myd88的变化
rna干扰组及对照组与lps组相比，myd88含量明显降低，rna干扰组与lps组myd88含量比值为1∶3.2，见图5。
2.3 myd88 sirna对dc细胞表面cd80、cd86及mhcⅱ分子的影响
流式细胞术结果显示，rna干扰组、对照组cd80、cd86及mhc ⅱ分子的表达明显低于lps组，见图6。
2.4 myd88 sirna对dc分泌细胞因子的影响
myd88 sirna可抑制lps 刺激引起的th1型细胞因子(tnfα、ifnγ、il12)的释放，rna干扰组及对照组与lps组相比差异均有显著性（p＜0.05），各组dc上清液中细胞因子的浓度,见图7。
2.5 混合淋巴细胞反应
lps组dc有明显刺激同种异体t细胞活化增殖作用，在浓度比为1∶100时仍有明显作用，而rna干扰组dc则不能有效刺激同种异体t细胞活化增殖，两组si差异有显著性意义（p＜0.01），见表1。表1 各组dc对同种异体t细胞的刺激指数(略)
3 讨论
dc作为最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell，apc)，是联结固有免疫和适应性免疫的主要细胞，参与多种疾病的发生、发展。dc过度活化可产生过量炎症因子，如tnfα、il1和il6等，导败血症和多器官功能衰竭［4］；dc过度活化促进dc成熟并表达共刺激分子和细胞因子,提呈抗原给t细胞，引起急、慢性排斥反应［5］。dc过度活化也可刺激免疫细胞成熟(如b细胞分泌抗体)，参与自身免疫性疾病及慢性炎性疾病的发生［6，7］。dc的不同表型对t细胞接受抗原刺激的反应状态有决定性作用，其成熟状态对上述疾病的发生、发展及预后起重要作用。成熟dc表达高水平mhcⅰ、ⅱ分子、共刺激分子和粘附分子，抗原递呈功能很强，活化初始型t细胞，激活适应性免疫；而未成熟dc尽管摄取抗原能力强，但不递呈抗原，且因缺乏共刺激分子表达，不提供t细胞活化必需的第二信号，可诱导t细胞无能或凋亡，导致免疫耐受［8］。抑制dc成熟是治疗上述疾病的有效方法。
最近研究表明，toll样受体及其信号途径在调控dc成熟过程中起重要作用。脂多糖(lps)、人类热休克蛋白（hsps）及细胞膜破损和应激释放的内源性物质等多种内外源性配体与toll样受体结合触发胞内级联信号传导反应，首先tlr胞浆区段与段衔接蛋白myd88相互作用，依次激活il1受体相关激酶(nik)和abiab激酶，最终使iκb磷酸化而降解，激活的nfκb移位入核内，启动免疫反应基因转录激活，从而促进dc活化。在tlrs信号传导过程中，各种信号物质的激活和失活必须依赖于myd88这种转载分子，其分子质量为35 ku，具有两个特殊的结构区域，即n端死亡域和c端tir结构域，c端tir域承接tlrs活化信号，n端死亡结构域激活胞内下游信号，其功能缺陷可导致信号传导中断［9］。以myd88为靶位阻断tlrs信号途径获得耐受性dc可能为治疗上述疾病提供新思路。
rna干扰(rna interference, rnai)技术是近年出现的新的基因技术，能在转录后水平抑制靶序列表达。其原理是21～25 nt小干涉rna(small interfering rna, sirna)进入哺乳动物细胞直接触发rnai，通过核酸内切酶、外切酶和解旋酶作用，特异性降解同源mrna，阻止靶蛋白表达。与反义技术、核酶技术及抗体介导的基因表达沉默技术相比，rnai具有高效、特异等优点［10］。针对信号通路中的关键分子myd88，我们采用化学合成法合成3对myd88sirna，筛选其中一对高效rna，其序列为：5′gacugauuccuauuaaaua3′和5′uauuuaauaggaaucaguc3′。
本实验研究了脂多糖刺激对dc成熟状态的影响。实验显示，未转染sirna的dc经lps刺激后其表面共刺激分子cd80、cd86及mhcⅱ分子均上调，分泌th1型细胞因子tnfα、ifnγ及il12明显增多，免疫组化显示dc内myd88表达增强，nfκb 也从胞浆移位至核内（nfκb的活化是dc成熟的标志之一），混合淋巴细胞培养检测示t细胞增殖能力提高，提示lps可通过激活tlrs信号传导通路促进dc成熟，激活特异性免疫反应，与以往研究结果一致［11］。
本实验还研究了myd88 sirna对dc表达myd88及其成熟状态的影响。myd88 sirna转染dc后，免疫细胞化学及western blot检测示该序列可显著抑制myd88的合成，lps刺激后dc共刺激分子cd80、cd86、mhcⅱ分子及th1型细胞因子均无明显上调，nfκb核移位被抑制，刺激t细胞增殖能力下降，说明myd88 rna干扰可抑制myd88的合成进而阻断dc内的信号传导，抑制dc成熟，增强dc的免疫耐受诱导作用。
本实验结果表明，myd88是tlrs信号途径中起重要作用的关键分子，myd88 rna干扰可阻断tlrs信号的转导，抑制dc成熟，产生耐受性dc，从而为临床应用耐受性dc治疗败血症、移植排斥反应、自身免疫性疾病及慢性炎性疾病提供新思路。尽管tlrs及其信号途径在疾病发生中的作用尚未完全阐明，以它们作为靶位进行疾病干预也还不成熟，但是可以推测，采用myd88 rna干扰技术阻断tlrs信号通路将是上述疾病很有前途的治疗措施。
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