med19在人胃癌中的表达及其临床意义
【摘要】 目的 研究med19基因在人胃癌组织中的表达情况及临床意义。方法 应用免疫组化和rtpcr方法检测med19 基因在胃癌组织、癌旁胃组织及正常胃组织中的表达。结果 胃癌组织中med19表达阳性率为71.7%（43/60），显著高于癌旁胃组织和正常胃组织（p<0.01）。癌旁胃组织和正常胃组织中med19多为阴性表达，少数为弱阳性表达，二者间差异无显著性（p> 0.05）。med19的表达与胃癌的细胞分化程度、淋巴结转移情况、tnm分期相关(p<0.05)，而在不同年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度的胃癌样本中表达差异无显著性（p> 0.05）。 结论 med19参与了胃癌的发生、发展过程，有望成为一个新的肿瘤治疗靶向因子。
【关键词】 med19；胃癌；基因表达
胃癌的发生主要与癌基因的突变、扩增、过度表达以及抑癌基因的突变、失活等密切相关。中介体亚单位med19 亚基在人类中的同源基因为肺癌转移相关基因lcmr1，目前对其功能研究较少。本研究观察胃癌组织中med19蛋白的表达及其与临床病理特征的关系，探讨med19表达与胃癌发生、发展的相关性。
1 材料与方法
1.1 对象与试剂
60例人胃癌组织标本来源于我院普外科，其中男36例，女24例，平均年龄58.2岁，所有标本均经病理证实为胃腺癌，且术前均未接受放疗和化疗。www.11665.cOm组织学检查为正常胃黏膜者20例源于胃镜活检标本。病理类型：高分化腺癌13例，中分化腺癌9例，低分化腺癌26例，未分化癌12例。tnm分期：ⅰ期8例，ⅱ期13例，ⅲ期19例，ⅳ期20例。本组60例均获临床随访，随访时间48～62个月，患者生存时间8～62个月，中位生存时间37个月。主要试剂med19购于美国cayman公司，med19上游引物：5′tgacaggcagcacgaatc3′；下游引物：5′caggtcaggcaggaagttac3′。内参照基因βactin引物序列：上游引物：5′cgagaagatgacccagatca3′；下游引物：5′gatcttcatgaggtagtcag3′；由上海生物工程有限公司合成。
1.2 试验方法
1.2.1 免疫组织化学方法检测med19蛋白表达
按sp免疫试剂盒说明书操作。阳性染色定位于肿瘤细胞胞核与胞浆，呈棕黄色颗粒状分布。在400倍视野下计数着色细胞占视野细胞总数的百分数，共计数5个视野，取平均值。肿瘤细胞阳性染色≤10%为阴性表达，>10%为阳性表达。
1.2.2 rtpcr方法检测med19 mrna表达
20例手术切除的新鲜胃癌组织和对应癌旁胃组织及正常胃组织置于液氮中冻存备用。提取mrna进行定量和定性分析。rtpcr：采用trizol一步法抽提胃癌组织总rna，经dna酶消化后逆转录。逆转录和pcr均设阴性对照。设定程序为两步法实时定量。预变性95℃，15 s；之后每一步变性95℃，5 s；退火延伸60℃，30 s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。pcr结束后，在95℃变性1 min。然后冷却至55℃，使dna 双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4 s，同时读取吸光值。
1.3 统计学处理
采用spss16.0统计软件分析，数据以x±s表示，两均数间的比较采用配对t检验；多组均数比较采用单因素或多因素方差分析。
2 结 果
2.1 med19蛋白的表达
阳性表达颗粒呈棕黄色，主要定位于肿瘤细胞胞浆和胞核内，尤其是癌灶边缘的内皮细胞及少量间质细胞也可呈弱阳性表达。染色存在异质性，即在不同组织和区域染色强度及染色面积不相同。胃癌组织中med19表达阳性率为71.7%（43/60），显著高于癌旁胃组织和正常胃组织（p<0.01）。癌旁胃组织和正常胃组织中med19多为阴性表达，少数为弱阳性表达，二者间差异无显著性（p> 0.05）。见表1、图1。
表1 med19在各组胃组织中的表达〔n(略) 〕
2.2 med19表达与临床病理特征的关系
med19蛋白的表达与胃癌的细胞分化程度、淋巴结转移情况、tnm分期相关(p<0.05)，而在不同年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度的胃癌样本中表达差异无显著性（p> 0.05）。见表2。表2 胃癌med19蛋白表达与临床病理特征的关系（略）
2.3 各组胃组织中med19 mrna的表达
图2为不同样本的rna抽提物电泳结果，可见胃癌组织标本的总rna中18 s、28 s条带很清晰，并有连续的mrna拖带，而未见dna条带，表明rna没有降解。
2.4 rtpcr反应扩增med19 mrna
采用2δδct法，以胃癌癌旁组织为参照，胃癌组织中med19 mrna表达高于癌旁组织和正常胃组织（p<0.05）。见表3。表3 各组med19 mrna含量的比较(略)
3 讨 论
rna聚合酶ⅱ是三大rna聚合酶之一，存在于基因转录装置的核心位置，编码蛋白质基因的转录受到rna聚合酶的调控。转录起始的精确性于核心启动子元件，而某些基因和组织特异的dna结合转录激活与中介体密切相关。med19（rox3）是中介体的一个亚单位，在转录激活和抑制中发挥重要作用，最初是在研究cyc7基因突变体中发现的〔1〕。med19基因刚开始发现时被认为是必需基因编码的蛋白产物，后来逐渐发现了缺失med19基因的酵母菌株，并且med19基因突变会阻碍gal4和gcn4诱导的基因活化作用〔2，3〕，baidoobonso等〔4〕研究发现med19在中介体复合物各部分内在相互作用中起着重要的调控作用，ding等〔5〕研究小组发现med19/med26在中介体复合物促进re1沉默转录因子诱导的神经基因表观沉默过程中发挥重要作用。中介体med19在基因转录过程中具有重要功能，与细胞的生长和周期调控关系紧密，因此本研究首先对med19基因在胃癌组织中的表达进行了研究。
本实验显示，med19蛋白在胃癌组织中呈异常的阳性表达，60例胃癌组织med19阳性率为71.7%；而癌旁胃组织和正常胃组织中均少量表达，分别为30%和15%。癌旁组织是光镜下处于癌组织周边，而形态结构正常的组织，med19在癌旁组织中高表达，在正常组织低表达，说明它由肿瘤组织产生，可能参与胃癌的发生。癌旁组织处于癌前病变时期，受到肿瘤组织分泌蛋白的作用，med19呈现一定程度的表达。med19在癌组织中的作用可能是刺激肿瘤细胞恶性增殖，促进肿瘤浸润性生长，其表达上调可能作为胃癌发生的一种早期标志。
本实验发现胃癌中med19表达与胃癌的肿瘤大小、细胞分化程度、tnm分期相关(p<0.05)，而与年龄、性别、浸润深度、淋巴结转移情况无关(p>0.05)。med19表达在肿瘤较大、组织分化差、tnm分期高者明显高于肿瘤小、高分化和低tnm分期者。同时本研究用荧光实时定量pcr方法观察med19 mrna在胃癌组织、癌旁组织和正常胃组织中的表达状况。结果显示，胃癌组织中med19 mrna比癌旁组织和正常胃组织表达量增高。以上结果从mrna转录水平和蛋白翻译水平上表明med19参与了胃癌的发生、发展过程，有望成为一个新的肿瘤治疗靶向因子。
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