gpr39 mrna在糖尿病大鼠不同组织中表达水平的差异
【摘要】 目的 研究gpr39 mrna在正常大鼠及糖尿病大鼠不同组织中的表达水平差异,探讨其在糖尿病发生发展中的作用。方法 采用实时荧光定量pcr仪检测正常大鼠与糖尿病大鼠胰腺组织、胃组织及肾脏中gpr39 mrna相对表达水平。结果 与正常组相比，gpr39 mrna在糖尿病大鼠胰腺组织中表达上调(p<0.05)，在胃组织表达下调(p<0.01)，在肾脏中表达差异无统计学意义（p＞0.05）。结论 gpr39可能与内分泌功能及代谢功能有关,并且在糖尿病的发展中起保护作用。
【关键词】 gpr39；obestatin；糖尿病；荧光定量pcr；胰腺；胃组织；肾脏
糖尿病是一种具有明显遗传倾向的多基因疾病，其发病机制十分复杂，环境因素和遗传因素相互作用，共同促成了糖尿病的发生。近年来，与糖尿病相关的多种基因的研究广泛展开。gpr39是肥胖抑制素的受体，与内分泌及代谢功能密切相关。目前，关于gpr39在糖尿病大鼠不同组织中的表达差异与糖尿病发生发展的相关机制的研究还很少，研究〔1〕发现在空腹及stz诱导的糖尿病大鼠脂肪组织中gpr39表达上调，在肝脏中却非常稳定，提示gpr39可能是改善代谢功能的一个靶点，在肝脏中gpr39可能还有一些其他的非代谢功能。目前尚未见糖尿病大鼠其他部位gpr39表达的研究报道，本研究采用实时荧光定量pcr仪检测正常大鼠与糖尿病大鼠胰腺组织、胃组织及肾脏中gpr39 mrna相对表达变化情况，进一步探讨gpr39与糖尿病发生发展的关系。wWW.11665.com
1 材料与方法
1.1 主要材料
链脲佐菌素(stz)，购自sigma公司，trizol试剂购自invitrogen公司。sybr r○primescripttm rtpcr试剂盒(drr063a) 购自takara公司。easy dilution购自takara公司。仪器采用abi7300实时荧光定量pcr仪。wistar大鼠由山东大学实验动物中心提供。引物由上海生工合成。
1.2 动物分组及处理
110～130 g健康雄性wistar大鼠30只。随机取15只作为正常对照组，其余15只造模。糖尿病模型采用腹腔注射stz 60 mg/kg，对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液。48 h后尾尖取血，测定血糖，血糖≥16.7 mmol/l者确定为糖尿病模型〔2〕，每周测血糖2次，不符合标准者弃去。各组均喂养2 w后处死，取胰腺、胃组织及肾脏经液氮速冻后保存于-80℃冰箱。
1.3 总rna的提取及pcr反应
取-80℃冰箱保存的组织50～100 mg，液氮研磨，trizol试剂提取总rna。1%甲醛变性凝胶电泳检测其完整性，紫外分光度仪测定纯度和含量，od260/280值1.9～2.1。pcr反应根据sybr r○primescript tm rtpcr kit (perfect real time)试剂盒说明。 pcr反应体系为：模板cdna 2 μl，2 ×syb r○premix ex taqtm10 μl，rox reference dye(50×) 0.4 μl，上下游引物各0.4 μl，加水至20 μl，每个样品重复3管。 所用引物根据文献〔3〕合成。gpr39引物：上游：5′agt gag gag agc cgg aca g3′；下游：5′cag tca tgt ttg ggt ttt gc3′，扩增产物长度131 bp。βactin引物：上游：5′ttc tac aat gag ctg cgt gtg3′；下游：5′ggg gtg ttg aag gtc tca aa3′，扩增产物121 bp。反应条件：95℃ 10s，95℃ 5 s， 62℃ 31 s,共40次循环。
1.4 统计学处理
所有数据均以x±s表示,并采用spss11.1统计软件进行数据整理和统计，两组间比较采用两样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 一般情况观察
实验组各大鼠血糖含量均在16.7 mmol/l以上。造模之前，大鼠毛色外观、活动、食欲及大小便等一般情况无明显异常及差异。造模后，糖尿病大鼠精神不振，活动较少，多饮，多食，多尿，消瘦，毛色发黄缺乏光泽。整个实验过程期间无大鼠死亡。
2.2 两组间gpr39 mrna在不同组织的相对表达量变化
正常组胰腺组织gpr39 mrna相对表达量为1，糖尿病组为1.77，糖尿病组表达上调，差异有统计学意义（p<0.05）。正常组胃组织gpr39 mrna相对表达量为0.23，糖尿病组为0.10，糖尿病组表达下调，差异有统计学意义（p<0.01）。正常组肾脏gpr39 mrna相对表达量为0.62，糖尿病组为0.57，差异无统计学意义（p＞0.05）。正常组大鼠胰腺、肾脏及胃组织中的表达差异显著，见表1。表1 gpr39在胰腺、胃组织及肾脏中的相对表达量（略）
3 讨 论
gpr39在人的空肠、回肠、十二指肠、胃、肝脏、脂肪组织、视网膜色素上皮细胞及垂体中高度表达〔4〕，在胰腺、肾脏、心脏、肺中也有表达〔1〕。关于gpr39的配体，目前仍存在争议，最初的研究认为，肥胖抑制素是其配体，能够与gpr39特异性结合，产生拮抗ghrelin的作用〔5，6〕，而最新的研究则发现gpr39信号的激活是由锌离子(zn2+)介导的〔3〕。gpr39的生理功能及作用机制方面的研究也因其配体的不确定而非常有限。moechars等〔7〕将gpr39（/）小鼠与gpr39（+/+）小鼠比较发现gpr39（/）小鼠的胃排空速度，胃肠蠕动，胆固醇水平及胃液分泌量都明显增加，另外在进食量一样的情况下体重及脂肪含量也增加。
tremblay等〔8〕的研究通过口服葡萄糖耐量测试发现gpr39(/)小鼠血糖水平升高，而胰岛素水平下降，gpr39能够自主调节irs2及pdx1的表达。holst〔9〕研究也得出相似结果，并且发现gpr39在多向性胰腺细胞（ar42j）向不同的分泌表型分化时表达有相反的趋势。dittmer〔10〕等的研究发现gpr39能够通过g 13/rhoa/sre依赖的通道诱导色素上皮细胞衍生因子(pedf)的产生或者增强其他的保护性转录物对抗氧化、内质网以及线粒体的压力，阻止细胞的凋亡。目前的研究还发现gpr39的转录受hnf1、hnf4及sp1等调节〔11〕。综上所述，gpr39可能在抑制摄食，促进胰岛素分泌及阻止细胞凋亡方面发挥重要作用。
本实验中，我们发现与正常大鼠相比，糖尿病大鼠胰腺组织gpr39表达显著上调，胃组织中表达显著下调，而肾脏组织中则无明显差异。根据以往的研究推测：① 在糖尿病大鼠胰腺中表达上调的机制可能与irs2及pdx1有关。 pdx1主要功能是调控胰腺的分化发育、胰岛b细胞胰岛素基因的转录、胰岛素颗粒成熟和分泌，还可以调节胰岛b细胞葡萄糖激酶基因、葡萄糖转运蛋白2及胰岛淀粉样多肽基因的表达。除此以外,pdx1可以促进胰腺干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞〔12〕，而irs2对胰岛b细胞的增殖起关键作用，并且irs2对胰岛b细胞数量和胰岛素抵抗之间的平衡也是一个关键的参与者〔13〕。由于b细胞的大量破坏，胰岛素缺乏及高糖刺激反馈上调了gpr39的表达，而gpr39通过上调irs2及pdx1的表达促进b细胞的增生，增加胰岛素的分泌及减轻胰岛素抵抗〔9〕。另外gpr39通过g13/rhoa/sre依赖的通道诱导产生色素上皮细胞衍生因子(pedf)及其他的保护性转录物对抗氧化、内质网以及线粒体的压力，可能在阻止b细胞的凋亡中发挥重要的作用〔10〕；② 在糖尿病大鼠胃组织中gpr39的表达下调说明它可能具有抑制摄食、延缓胃排空的作用，并且提示肥胖抑制素可能是gpr39的配体。而在糖尿病大鼠肾脏中gpr39表达无差异说明gpr39在肾脏代谢中可能不发挥作用。综上所述，gpr39可能是在糖尿病的发生发展中起保护作用的一个受体，gpr39作为一个治疗靶点，其激动剂在治疗糖尿病中可能具有重要的意义。
【参考文献】
1 egerod kl，holst b，petersen ps，et al.gpr39 splice variants versus antisense gene lypd1：expression and regulation in gastrointestinal tract，endocrine pancreas，liver，and white adipose tissue〔j〕. endocrinol，2007；21：168598.
2 沈东波，高原，杜飞，等.灯盏花素在大鼠糖尿病早期对近球小管钠钾atp酶活性的影响〔j〕.中国药理学通报,2007；23(7)：91720.
3 holst b，egerod k，schild e,et al.gpr39 signaling is stimulated by zincions but not by obestatin〔j〕.endocrinology，2006；7：123.
4 camia j，campos j，caminos j e,et al.obestatinmediated proliferation of human retinal pigment epithelial cells：regulatory mechanisms〔j〕.j cell physiol，2007；211(1):19.
5 zhang j，ren p，avsian kretchmer o,et al.obestatin，a peptide encoded by the ghrelin gene，opposes ghrelin′s effects on food intake〔j〕.science，2005；310：9969.
6 eva m，egido，raquel hernández,et al.effect of obestatin on insulin，glucagon and somatostatin secretion in the perfused〔j〕.regulatory peptides，2009；152(1)：616.
7 moechars d，depoortere i，moreaux b,et al.altered gastrointestinal and metabolic function in the gpr39obestatin receptorknockout mouse〔j〕. gastroenterology，2006；131：113141.
8 tremblay f，richard am，will s，et al.disruption of g proteincoupled receptor 39 impairs insulin secretion in vivo〔j〕.endocrinology，2009；150(6)：258695.
9 holst b，kristoffer l，egerod,et al. g proteincoupled receptor 39 deficiency is associated with pancreatic islet dysfunction〔j〕. endocrinology，2009；150：257785.
10 dittmer s，sahin im，pantlen a,et al.the constitutively active orphan gproteincoupled receptor gpr39 protects from cell death by increasing secretion of pigment epitheliumderived growth factor〔j〕.j biol chem，2008；283(11)：707481.
11 fajans s，bell g，polonsky k,et al.molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturityonset diabetes of the young〔j〕.n engl med，2001；345：97180.
12 黄金华.pdx1与糖尿病的研究进展〔j〕.医学综述，2008；6：893903.
13 秦胜花.胰岛素受体、胰岛素受体底物2在胰岛b细胞中的作用〔j〕.广西医科大学学报，2005；22(4).
