作者：肖子曾,戴冰,刘磊,冷旺,邹双华

【摘要】  目的 探讨六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响。方法 原代培养大鼠前脂肪细胞,用四甲基偶氮唑盐(mtt)方法检测六味地黄丸含药血清对前脂肪细胞的增殖情况,以酶组织化学法检测其对前脂肪细胞分化过程中的磷酸甘油脱氢酶(gpdh)的影响,油红o染色方法测定其对细胞内脂肪积聚的影响。结果 10%以内六味地黄丸含药血清对大鼠前脂肪细胞的增殖有促进作用,对分化过程中的gpdh升高有抑制作用,而对于分化过程中的脂肪积聚则有促进分解的作用。结论 六味地黄丸能促进大鼠前脂肪细胞的增殖,抑制大鼠前脂肪细胞的分化。

【关键词】  六味地黄丸；大鼠；前脂肪细胞；细胞增殖；细胞分化

　　abstract：objective to investigate the influence of liuwei dihuang pills on proliferation and differentiation of rat preadipocytes. methods rat preadipocytes were cultured, the influence of liuwei dihuang drug-containing serum on proliferation of rat preadipocytes was detected by mtt method, the influence of liuwei dihuang drug-containing serum on expression of gpdh was determined by enzyme tissue chemical method, the effect on lipid accumulation was determined by oil red o staining. results liuwei dihuang drug-containing serum stimulated rat preadipocyte proliferation, inhibited gpdh up-regulation during differentiation, inhibited lipid accumulation in cell differentiation with the concentration below 10%. conclusion liuwei dihuang pills stimulated rat preadipocyte proliferation, inhibited rat preadipocyte differentiation.

　　key words：liuwei dihuang pills；rat；preadipocytes；cell proliferation；cell differentiation

　　研究表明,口服六味地黄汤能明显降低实验性高血脂大鼠总胆固醇和肝中脂肪含量[1],提示其对脂肪细胞的增殖、分化可能有一定影响。WWw.11665.CoM现已有报道,肥胖是引发上述疾病的重要因素[2]。从细胞水平看,肥胖是由于前脂肪细胞的不断分化所致的脂肪细胞数目增多及体积增大引起。脂肪细胞的分化将影响糖脂代谢,进而影响代谢性疾病的发生发展。为观察六味地黄丸对脂肪细胞的增殖、分化究竟有无影响,我们进行了以下实验研究,现报道如下。

　　1  实验材料

　　1.1  药物及试剂
  
　　六味地黄丸(长沙九芝堂,批号20050361)；地塞米松(批号123k06612),胰岛素(批号024k1188),含酚红dmem低糖培养基(批号123k83031),磷酸二羟丙酮(批号027k1635),上述试剂均购自sigma公司；mtt(批号1313bl1)购自amresco公司；标准胎牛血清(批号20050617)购自兰州民海生物工程有限公司；油红0(批号830120)购自北京夏新试剂分装厂。dmso购自宜兴市化工厂；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。

　　1.2  动物

    健康wistar大鼠,清洁级,雌雄各半,体重(200±20)g,湖南中医药大学实验动物中心提供,合格证号:医动字第0-002号。

　　2  方法与结果

　　2.1  六味地黄丸药液的制备

　　取六味地黄丸200丸(每8丸相当于原药材量3 g),加纯净水约300 ml,搅拌,煮沸,使之完全溶解后,添加纯净水至375 ml,使其药液浓缩至2.0 g/ml(以原药材含量计),供实验用。

　　2.2  空白及含药血清样品制备
   
　　取wistar大鼠, 雌雄各半,随机分为对照组(a组)和六味地黄丸高(b组)、中(c组)、低(d组)剂量组,每组30只。禁食12 h(自由饮水),按照30 g/kg(以原药材含量计)剂量(相当于临床等效剂量的12倍,临床等效剂量即为人的临床用药量换算成大鼠的等效剂量),分别灌胃给予蒸馏水和六味地黄丸给药样品溶液,1%戊巴比妥钠麻醉,经肝门静脉取血5 ml,离心血液,取上清液过0.22 μm微孔滤膜后用于实验。

　　2.3  大鼠前脂肪细胞的培养
   
　　取雄性大鼠腹股沟部纯净脂肪颗粒,ph 7.2缓冲生理盐水(pbs)洗涤,剪成0.5～l mm3大小均匀的小颗粒,以1 000 r/min离心10 min,取上层的纯脂肪颗粒轻轻地铺于经培养液润湿的培养瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的dmem/低糖培养液5～10 ml,塞紧瓶塞,将底面翻转朝上。37 ℃、5% c02培养1～2 h,待粘附牢固后,翻转培养瓶做正常培养,每日观察。原代培养区域单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代,取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验。

　　2.4  大鼠前脂肪细胞生长曲线

    按文献[3]方法测定,从生长曲线可见前脂肪细胞的倍增时间约为60 h。

　　2.5  酶组织化学提取法测定大鼠前脂肪细胞分化过程中的标志物――甘油磷酸脱氢酶(gpdh)动态变化
   
　　根据文献[4]的方法进行测定。结果传代细胞形成单层汇合后,在胰岛素10 μmol/l和地塞米松1 μmol/l的作用下即开始上升并迅速增加,10 d左右到达高峰并维持在高水平。形态上表现为单层汇合1周后,细胞内出现大量脂滴。

　　2.6  油红o染色提取法测定脂肪细胞内脂肪含量

　　用pbs冲洗2～3次,加入10%的甲醛缓冲液室温下固定1 h,去固定液,加入油红o染色,室温下染色2 h,去染色剂,以无菌双蒸水冲洗2次,洗去未着色的染料,倒置显微镜下观察,照相。结束后,以异丙醇溶解,490 nm酶标仪下测吸光度,以吸光度(a值)表示,画出时间-a值曲线。结果前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7 d后迅速增加,11 d左右到达高峰,与形态学上的单层汇合后1周左右细胞内出现脂肪颗粒完全吻合。细胞内脂肪含量的增加比gpdh的出现要晚6 d左右,说明酶的出现在先,脂肪出现在后。

　　2.7  分组及给药

　　将第4代的大鼠前脂肪细胞接种到96孔板,贴壁后于96孔培养板每6孔一组,分为4组：10%空白大鼠血清组,六味地黄丸药物血清高、中、低剂量组(浓度分别为10%、5%、2.5%,简称高、中、低剂量组)。上述各组所含血清的终浓度均为10%,血清含量不足者以空白大鼠血清补齐。

　　2.8  六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖的影响

　　配制大鼠前脂肪细胞增殖培养液：dmem/低糖＋空白大鼠血清,分别与六味地黄丸含药血清共同溶解于培养液中,其终浓度同“2.7”项。取第4代的大鼠前脂肪细胞,以10 000个/孔接入96孔培养板中,37 ℃、5% c02培养12 h。分别加入上述配制的各种含药培养液,再培养48 h。将浓度为5 g/l mtt液与10%空白大鼠血清的dmem培养液按体积(1∶9)配成mtt培养液。移出培养液,换上mtt培养液培养4 h,吸干培养液,每孔加100 μl dmso,混匀后置酶标仪490 nm观测吸光度值,观察各浓度含药血清对前脂肪细胞增殖的影响,测定各孔吸光度(a值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。结果见表1。

　　2.9  六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶的影响

　　配制大鼠前脂肪细胞分化培养液：dmem/低糖＋空白大鼠血清＋胰岛素10 μmol/l＋地塞米松1 μmol/l.以分化培养液配制不同浓度六味地黄丸含药血清培养液,其终浓度同“2.7”。取第4代的细胞以30 000个/孔接种于96孔培养板中,37 ℃、5% co2培养5 d,分别加入上述配制的各培养液,再培养5 d。培养结束后, 酶组织化学提取法测定gpdh的活性,紫外分光光度计340 nm波长处观测吸光度值。以吸光度(a值)间接表示酶的活性,6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行统计分析。结果见表1。

　　2.10  六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响
   
　　培养液的配制同“2.7”项,取第3代的大鼠前脂肪细胞以30 000细胞/孔接种入96孔培养板中,于37 ℃、5% co2培养10 d后,加入“2.7”项配制好的含药培养液,再于同样条件下培养5 d。培养结束后,细胞用10%的甲醛固定1 h,用油红0工作液(2 g/l)染色2 h,用双蒸水充分洗净,培养板放入37 ℃温箱使残余水分蒸发,用异丙醇溶解细胞内油红0,置酶标仪510 nm观测吸光度(a值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。结果见表1。表1  六味地黄丸含药血清对大鼠前脂肪细胞增殖、gpdh、脂肪分解作用的影响(略)注：与a组比较,△p<0.05,△△p<0.01。

　　3  讨论
   
　　能量摄入长期超过能量消耗,大多数多余能量以三酰甘油的形式储存在脂肪细胞,从而导致脂肪细胞的增生和肥大。增殖和分化是细胞发育过程中的两个不同方面,脂肪组织含有增殖、分化活跃的前脂肪细胞,它的存在和作用持久,与肥胖及脂肪移植成活率都有密切的关系。有研究表明,其分化异常可导致一系列代谢性疾病发生[2]。实验发现,六味地黄丸可抑制大鼠前脂肪细胞的分化,促进大鼠前脂肪细胞的增殖。
   
　　由于含药血清加入机体反应体系后,浓度被稀释,从而使反应体系药物浓度达不到在体条件下的药物浓度,有人认为给药剂量应以整体模型动物的有效剂量(即临床成人剂量的8～18倍量)为妥[5]。由于本实验中六味地黄丸配制出的最大灌胃药液剂量大约为临床成人剂量的12倍,故实验时选择了12倍临床剂量的给药量。

　　有研究认为,在采用血清药理学方法进行研究时,应考虑血清本身所含物质及血清体积等因素对体外实验结果的影响,中药复方血清药理实验中体外培养液中的含药血清浓度,应以临床等效剂量为基准,以10%较为合适,一般不超过培养液的20%,过高或过低都不宜[5]。故本实验所取复方药物血清浓度在10%以内。
   
　　本实验研究表明,大鼠前脂肪细胞经传代培养后,进入对数生长期时间约为60 h；gpdh作为前脂肪细胞分化的标志性酶,在传代细胞形成单层汇合后,在10 μmol/l胰岛素和1 μmol/l地塞米松的作用下即开始上升并迅速增加,10 d到达高峰并维持在高水平；前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7 d后迅速增加,11 d左右到达高峰,故本实验选择在大鼠前脂肪细胞生长稳定后的第48小时加入各含药培养液，以观察其对大鼠前脂肪细胞增殖的影响；在大鼠前脂肪细胞促分化生长的第5天加入各含药培养液,以观察其对大鼠前脂肪细胞分化过程中gpdh的影响。在大鼠前脂肪细胞促分化生长的第10天加入各含药培养液以观察其对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响。但六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖、分化过程中的各个阶段有何影响,其作用的确切机理为何,尚有待于深入研究。
　　

【参考文献】
  　[1] 王秋娟.六味地黄煎剂研究ⅰ：全丸及拆丸对小鼠耐缺氧与降血脂的作用[j].中国药科大学学报,1990,21(4)：241.

　　[2] bloomgarden zt.obesity hypertension and insulin resistance[j]. diabetes care,2002,25(11)：2088－2097.

　　[3] 马瑾瑜,顾映红,余竹元.用快速比色计量法测定细胞生长[j].上海医科大学学报,1993,20：309－311.

　　[4] stuart j,simpson js.dehydrogenase enzyme cytochemistry of unfixed leucocytes[j].j clin path,1970,23：517－521.

　　[5] 李振光,王净净.关于中药血清药理学方法的思考[j].中国中医药信息杂志,2002,9(2)：5－6.