作者：陈武,周洪亮1王海丹1刘志辉
【摘要】 目的 采用多药效学指标确定乌鳖颗粒中黄狗肾的提取工艺。方法 比较黄狗肾95%乙醇提取和70%乙醇提取两种工艺对卵巢摘除大鼠雌激素活性以及对幼鼠子宫、卵巢发育的影响。结果 两种提取工艺的提取物均可使卵巢摘除大鼠血清雌二醇水平增高;95%乙醇工艺提取还具有提高大鼠雌激素活性及促进幼鼠子宫、卵巢生长的作用。结论 乌鳖颗粒中黄狗肾饮片应采用95%乙醇提取。
【关键词】 乌鳖颗粒;黄狗肾;提取工艺;多药效学指标评价
abstract：objective to define the extraction process of dog penis in wubie granules by multiple pharmacodynamics indicators. methods rat ovaries were removed by operation. the effect of 95% alcohol extraction and 70% alcohol extraction were compared on uterus and ovaries development of immature mice and estrogen activity of rats with operation. results products of both processes could raise e2 level in serum of rats with operation, 95% alcohol extraction could also enhance estrogen activity of rats and develop uterus and ovaries of immature mice. conclusion dog penis in wubie granules should be extracted by 95% alcohol.
key words：wubie granules;dog penis;extraction process;multiple pharmacodynamics index evaluation
乌鳖颗粒来源于江苏省中医院名老中医夏桂成教授临床经验方,由黄狗肾、制何首乌和鳖甲等7味药组成,临床上用于治疗卵巢功能早衰。www.11665.com黄狗肾为犬科动物狗canis familiaris l.的干燥阴茎和睾丸,具有暖肾、壮阳、益精功效[1]。目前黄狗肾文献报道比较少,物质基础研究薄弱,有效成分尚不明确,为保证制剂疗效,笔者采用多药效学指标评价方法对黄狗肾提取工艺进行探索。
1 实验材料
1.1 动物
雌性sd大鼠,体重120～140 g,由浙江大学实验动物中心提供,动物合格证号：scxk(浙)2008-0033。icr小鼠,体重14～18 g,由扬州大学实验动物中心提供,动物合格证号：scxk(苏) 2007-0001。
1.2 仪器
sp-756pc型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);ldz5-2型离心机(北京京立离心机有限公司);r-911全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司);fa1004电子分析天平(上海精科天平厂)。
1.3 药物与试剂
六味地黄丸(河南宛西制药股份有限公司,批号090872)。黄狗肾及方中饮片均购于江苏省医药公司,经鉴定符合相关要求。红四氮唑(ttc,上海试剂三厂,批号961115);四氯乙烯(中国医药集团上海化学试剂公司,批号20010203);无水乙醇(上海久亿化学试剂有限公司,批号20090210)。雌二醇(e2)试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号20091128);促卵泡激素(fsh)试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号20091128);黄体生成素(lh)试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号20091128)。
2 方法与结果
2.1 供试液制备方法
工艺a提取液：按处方比例称取饮片,黄狗肾加10倍量95%乙醇回流提取2次,每次1 h,滤过,药液与药渣备用;枸杞子、茯苓加10倍量水煎煮2次,每次1 h,滤过,合并滤液,浓缩至相对密度为1.20(60 ℃测)的浸膏,备用;黄狗肾药渣与方中其他饮片加10倍量水煎煮2次,每次2 h,滤过,合并滤液,浓缩至相对密度1.15(80 ℃测),加乙醇至含量为60%,静置48 h,抽滤,滤液与黄狗肾液合并回收乙醇至尽,再与枸杞子、茯苓提取液合并即得。
工艺b提取液：按处方比例称取饮片,黄狗肾加10倍量70%乙醇回流提取2次,每次1 h,滤过,药液与药渣备用;其余6味饮片的处理同工艺a。
阳性对照液：取六味地黄丸捣碎,研成粉状,然后加入蒸馏水混溶,即得。
阴性对照液：按处方比例称取饮片(缺黄狗肾),饮片的处理同工艺a。
2.2 统计学方法
数据用—(—用)±s表示,采用t检验,用spss11.0统计软件进行统计分析。
2.3 对卵巢摘除大鼠雌激素活性的影响
取雌性sd大鼠85只,除正常对照组10只外,其余75只去除双侧卵巢,手术后2周,将手术成功的大鼠随机分组,每组10只。各组按下述剂量每日灌胃给予相应药物1次,正常对照组和模型组：等量生理盐水;阳性对照组：3 g/kg六味地黄丸;工艺a组：11 g/kg;工艺b组：11 g/kg;阴性对照组：11 g/kg。每日灌胃1次,连续给药4周。末次给药30 min后,每鼠阴道内缓缓注入新鲜配制的25 mg/ml ttc水溶液0.1 ml,于阴道内停留30 min,取血,离心,取血清测e2、fsh、lh水平。立即处死,剪取大鼠阴道,纵行切开,分离阴道,剪碎后置离心试管中,加入无水乙醇和四氯乙烯混合溶液4 ml,浸泡提取2 h, 2 000 r/min离心5 min。吸取上清液,以无水乙醇和四氯乙烯混合液作空白对照,于490 nm处测定a值[2-4]。
结果表明,工艺a组和工艺b组均可使卵巢摘除大鼠血清e2水平增高,与模型组比较差异有统计学意义(p<0.01)。提示工艺a组和工艺b组具有调节机体激素水平的作用。工艺a组的od值与模型组比较差异有统计学意义(p<0.01),提示工艺a组可明显增加大鼠阴道角化上皮细胞,具有提高雌激素活性的作用。见表1、表2。表1 对卵巢摘除大鼠血清e2、fsh、lh活性的影响(—(—的)±s)表2 对卵巢摘除大鼠雌激素活性的影响(—(—巢)±s)
2.4 对幼鼠子宫、卵巢发育的影响
取未成熟icr健康雌性幼鼠(体重14～18 g)60只,随机分为空白对照组(灌胃等量生理盐水)、阳性对照组(4.5 g/kg)、工艺a组(16.5 g/kg)、工艺b组(16.5 g/kg)、阴性对照组(16.5 g/kg)。各组均灌胃给予相应药物,剂量0.2 ml/10 g, 1次/d×10 d。末次给药后12 h,脱颈椎处死,解剖,取子宫、卵巢、脾、胸腺,分离脂肪,迅速以电子天平称重。计算脾、胸腺、卵巢、子宫系数 [2]。结果表明,工艺a组促进子宫、卵巢和胸腺生长,与空白组比较差异有统计学意义(p<0.05)。提示工艺a组具有促进子宫、卵巢发育的作用。见表3。 表3 对幼鼠子宫、卵巢、脾、胸腺发育的影响(—(—鼠)±s)
3 讨论
鞭类中药饮片的服用方法主要包括研粉吞服、煮食和泡酒内服。谭氏等[5]研究结果表明,狗鞭(黄狗肾)饮片匀浆后的混悬液对肾阳虚型动物有不同程度的壮阳作用;文献报道其主要含雄性激素、蛋白质、维生素e、脂肪和有机纤维等成分[6]。
本试验结果表明,乌鳖颗粒中黄狗肾不同乙醇浓度提取工艺(工艺a和工艺b)的提取物均可使卵巢摘除大鼠血清e2水平增高;此外,用95%乙醇提取工艺(工艺a)制备的提取物还具有较好的提高大鼠雌激素活性,促进子宫、卵巢生长的作用,这与乌鳖颗粒治疗卵巢功能早衰目的一致。综合上述分析,方中黄狗肾饮片应用95%乙醇提取。
提取黄狗肾所用乙醇浓度不同,对药效的影响也不同,浓度高者药效明显好,这是否提示黄狗肾中极性较低的成分是其有效成分,有待进一步研究。
【参考文献】
[1] 江苏省卫生厅.江苏省中药饮片炮制规范[m].南京：江苏科学技术出版社,1992.443.
[2] 李仪奎.中药药理实验方法学[m].上海：上海科学技术出版社,2006.836.
[3] 张军武.归肾丸对大鼠卵巢早衰防治作用的实验研究[j].中国现代医药杂志,2008,10(6)：79-80.
[4] 戚本明,戚本玲.葛根提取物对正常及去势大鼠血清雌激素水平影响的研究[j].中国中药杂志,2002,27(11)：850-851.
[5] 谭兴贵,曾 嵘,贺福元.鹿鞭、狗鞭、牛鞭的壮阳作用实验研究[j].中医药学报,2001,29(6)：33-34.
[6] 窦立院.介绍柴狗肾[j].中药饮片,1993,(1)：32-33.
