【摘要】 目的 对比性研究bouin液和4%中性甲醛固定液对子宫内膜标本固定性能。方法 选用2种固定液对新鲜子宫内膜标本固定2小时后，常规脱水、浸蜡、包埋、制片并进行对比性观察。结果 对36例功血患者子宫内膜切片比较性研究，经bouin液固定后所制切片较4%中性甲醛固定液所制切片多个方面观察研究具有显著的优势。结论 经bouin液固定的子宫内膜标本，具有优良的制片质量，对于需要尽快取得病理诊断报告的患者，选用bouin液固定标本可以在较短时间内得到高质量病理切片。
【关键词】 bouin液 4%中性甲醛固定液 子宫内膜 职称论文
病理技术是病理学研究和诊断不可分割的一部分，各种各样的病理技术能够精细地显示与表达病变区域的细胞组成、组织结构以及基因序列的变异等多层次的信息。为病理学研究和诊断提供更加科学、准确和可靠的形态学依据，提高了诊断正确率，便于临床对患者的及时准确的治疗。在所有工作中，组织固定是病理标本制备的第一步，至关重要，是所有病理后续工作的基础。
在日常工作中，子宫内膜标本的制片一直是病理工作中的一个难点，由此我们尝试采用不同的固定方法，研究如何避免因组织不能充分固定，导致制片质量差，诊断困难的现象。自2008年3月开始，我们分别用bouin液和4%中性甲醛固定液对36例子宫功能性出血患者的子宫内膜组织作了对比，效果满意。
1材料与方法
1.1.材料 子宫内膜标本来源于2008年3月-2009年11月本院妇产科门诊的功能性出血患者36例。年龄21~65岁，经询问病史及诊查后，未发现有周身及生殖器官器质性病变。WWW.11665.cOm患者主要临床表现为月经过多，经期延长7天以上，月经紊乱，不规则子宫出血，闭经后子宫出血。
1.2主要试剂 4%中性甲醛固定液（饱和甲醛溶液10ml+ph7.4mol/l磷酸缓冲液90ml），bouin固定液（苦味酸75ml+40%甲醛溶液25ml+冰醋酸5ml），乙醇，二甲苯，盐酸及石蜡等。
1.3方法 将配好的bouin液和4%中性甲醛固定液交给临床医师保存。同一患者刮取的内膜组织，立即分别放入2种固定液中。固定2小时后，经4%中性甲醛固定液的组织按常规石蜡包埋。经bouin液固定的组织用70%~80%乙醇洗涤，去除组织中苦味酸染色，然后按常规石蜡包埋。最后两者制片效果及组织切片he染色，显微镜下作一比较。
1.4统计学分析: 结果均以平均数±标准差（±s）表示，采用spss11.5统计学软件分析，两组间比较用t检验。
2结 果
2.1肉眼观察 见子宫内膜组织入bouin液立即由红色变白色，而入4%中性甲醛固定液中则是逐渐由红变白。
2.2石蜡切片过程 用bouin液固定过的组织蜡块，组织质地硬度适当，切片连续，完整，切片合格率99%（p<0.005）；用4%中性甲醛固定液过的组织蜡块，组织质地较软，切片不连续，不完整，切片合格率70%（p<0.005）。
2.3显微镜（物镜*40）下观察：用bouin液固定过的组织的he染色色彩亮丽，对比清晰，子宫内膜腺体细胞与间质细胞结构清晰，组织结构分明（图1）；高倍镜下细胞结构也很清晰（图2）。4%中性甲醛固定液固定过的组织色彩较暗，对比不够清晰，子宫内膜腺体细胞与间质细胞结构较模糊，组织结构比较分明（图3）；高倍镜下细胞结构不清晰（图4）。
3.讨 论
组织的固定是形态学研究中不可缺少的重要步骤，其目的:（1）抑制细胞内溶酶体酶的释放和活性，防止自溶；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败；（2）使细胞的蛋白质、脂肪、糖、各种成分凝固成不溶性物质，以防止物质扩散并维持原有的组织形态结构；（3）固定后的组织对染料有不同的亲和力，染色后的组织其构成比有较大的差别，因此对固定剂的要求不同。（4）有利于切片，固定剂有硬化作用，使组织硬度增加，是细胞的正常的半液体状变为半固体状，有固化作用，便于制片。
本研究显示有效而充分的固定是保存子宫内膜组织结构的关键，直接关系到病理诊断的准确性。4%中性甲醛固定液虽然是一种常用的良好固定液，渗透力强、组织收缩小，甲醛对组织穿透力强，对低分子的多肽、蛋白、糖、脂肪、高尔基体和线粒体等固定效果较好，细胞核的染色佳。然而甲醛易氧化为甲酸，降低固定效果，使溶液变酸，过酸会影响核的染色。此外固定时间过长，组织中可产生甲醛色素影响观察，也可使某些抗原发生空间构象改变而遮蔽抗原决定簇【1】，由于甲醛渗透速度较慢，一般的组织需固定4~12h，对厚度适当的组织固定较为均匀，但对活检一类的组织固定后再用乙醇脱水会使组织较硬，并且对染色质的固定效果差。当新鲜的子宫内膜组织入甲醛固定液中时，肉眼可见组织颜色是逐渐由红变白，由此说明4%甲醛渗透速度慢。两组标本用同一种苏木精染色，但染色后色彩不够亮丽，结构虽然清晰，但不够分明，而且在制片过程中有难度，导致切片质量欠佳，对诊断带来一定的困难。由于染色的过程两组相同，从而避免染色因素的干扰，常规病理工作中4%中性甲醛固定大标本均未出现此现象，而且有学者指出甲醛对染料的阻断作用是可逆的，主要是有关的蛋白发生交联，形成蛋白分子的弥散屏障，从而阻断了染料的扩散【2】。

图1：用bouin液固定过的组织的he染色色彩亮丽，对比清晰，子宫内膜腺体细胞与间质细胞结构清晰，组织结构分明。

图2：高倍镜下细胞结构也很清晰。

图3：4%中性甲醛固定液固定过的组织色彩较暗，对比不够清晰，子宫内膜腺体细胞与间质细胞结构较模糊，组织结构比较分明。

图4：高倍镜下细胞结构不清晰。
bouin液是由甲醛、冰乙酸、苦味酸饱和液5：1：15组成，偏酸性，对所固定组织的抗原具有一定程度的损害，故其在免疫组织化学的应用中较4%中性甲醛有所限制，但在常规染色中它仍然是一种良好的固定液，具有穿透速度快、收缩小、固定均匀、固定过的组织有适当的硬度、染色效果好，其中冰乙酸的渗透力强，能较好地沉淀核蛋白，保存染色体，有助于细胞核着色；苦味酸能使组织适当硬化；适量的甲醛则可以调节前两种试剂对组织的膨胀作用，可防止冰乙酸对染色质及苦味酸对细胞质强烈作用所产生的粗大沉淀【3】。因此用bouin液固定只需要1~2h。由于其穿透速度快，子宫内膜组织被迅速凝固，肉眼可见活检组织入bouin液后立即由红变白，因此用bouin液使子宫内膜组织中的腺体细胞与间质细胞快速凝固，使得人为破坏减少，并且用bouin液固定的组织制作的片子完整，质量好，he染色对比明显，镜下观察细胞层次分明，细胞清晰可见，明显优于4%中性甲醛固定的组织，使得镜下的准确率明显提高。

研究显示：经bouin液固定的子宫内膜标本，具有优良的制片质量，对于需要尽快取得病理诊断报告的患者，选用bouin液固定标本可以在较短时间内得到高质量病理切片。在制片过程中须注意以下几点：（1）标本离体后迅速固定，以免组织细胞变性影响制片。（2）固定液应为标本体积的5~10倍。（3）包埋时避免镊子过热，以免烫伤组织，影响制作质量及诊断
参考文献
[1]倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.北京科学技术出版社，1933：44-63
[2]wingren u,enerbäck l. mucosal mast cells of the rat intestine: are-evaluation of fixation and staining properties, with special reference to protein blocking and solubility of the granular glycosaminoglycan.histochem j,1983,15(6):571-582
[3] 方福德等（主编）.现代医学实验技术全书（上册）.北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995：243