作者：蒋荣珍,欧阳小光,黄斌,罗国琼
【摘要】 目的 优选黄芩的最佳提取工艺条件。方法 以黄芩苷提取率为指标,乙醇浓度、回流时间及溶剂量为考察因素,采用星点设计-效应面优化法优选提取工艺条件,并进行预测分析。结果 最优提取工艺条件为乙醇浓度45%、提取时间120 min、溶剂用量4倍,二项式拟和复合相关系数较高r＝0.975 9,提取率预测值与理论值偏差率为-3.86%。结论 星点设计-效应面法优选黄芩提取工艺方法简单、精密度高、预测性好。
【关键词】 星点设计-效应面法；黄芩；黄芩苷
abstract：objective to obtain the optimal extraction process of prunella vulgaris l. methods with the dependent variables of ethanol concentration, reflux time and solvent fold, and dependent variable of the amount of baicalin, central composite design/response surface method was applied to optimize the reflux extraction process. predictions were carried out by comparing the observed and predicted values. results the optimum conditions of extraction process were 45% ethanol, 2 hours for reflux, 4 fold sovent. regression coefficients of binomial fitting complex model was 0.9759. bias between observed values and predicted values was -3.86%. conclusion the optimum model is simple, precise and highly predictive.
key words：central composite design/response surface method；radix scutellariae；baicalin
星点设计由于其精度高、预测值接近真实值,是国外常用的试验设计方法。WWW.11665.cOm近年来,国内仅有少数学者采用星点设计-效应面法替代常用的正交或均匀设计,并应用于药学相关领域。本试验引入星点设计方法,结合效应面法优选黄芩中有效成分黄芩苷回流提取工艺,旨在优化回流提取工艺的同时,为探讨星点设计-效应面法应用于中药提取工艺的可行性提供依据。
1 仪器与试药
agilent1100系列高效液相色谱仪(vwd检测器、agilent 10.02色谱工作站)；电子分析天平(sartorius,德国)。黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号110709- 200304,供含量测定用)；黄芩(购自广西南宁医药公司)。乙腈(色谱纯,美国fisher),磷酸(色谱纯,天津四友),其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 黄芩苷含量测定
2.1.1 色谱条件
色谱柱为lichrospher-c18(5 μm,4.6×250 mm)；流动相为甲醇-水-磷酸(55∶45∶0.2)；流速1 ml/min；柱温25 ℃；检测波长280 nm。。
2.1.2 对照品溶液的制备
精密称取黄芩苷对照品适量,置10 ml容量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,制成含黄芩苷50 μg/ml的溶液,作为对照品溶液。
2.1.3 样品溶液的制备
精密吸取提取液1.0 ml,置10 ml棕色量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,10 000 r/min离心10 min,即得。
2.1.4 线性及范围
吸取黄芩苷对照品溶液(50 μg/ml)1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 μl,分别注入色谱仪,以峰面积为纵坐标,黄芩苷进样量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程：y＝3.933 3＋2 681.818 2x,相关系数r＝0.999 9,线性范围为0.050～0.750 μg。
2.1.5 精密度试验
精密吸取同一样品溶液10 μl,重复测定6次,黄芩苷峰面积rsd＝1.06%。
2.1.6 重复性试验
精密量取同一提取液6份,按“2.1.3”项下方法制备,分别测定,进样10 μl,各样品黄芩苷浓度rsd＝1.24%。
2.1.7 稳定性试验
精密吸取提取液1.0 ml,按“2.1.3”项下方法制备,分别在0、2、4、8、12 h测定,黄芩苷峰面积rsd＝1.73%。
2.1.8 加样回收率考察
精密吸取已知含量的提取液样品1.0 ml,共6份,分别精密加入黄芩苷对照品溶液(0.73 mg/ml) 2.0 ml,按“2.1.3”项下方法操作。吸取10 μl,注入色谱仪,测定。平均回收率为98.3%,rsd＝2.50%。
2.2 黄芩中黄芩苷回流提取工艺优化
2.2.1 试验设计及结果
预试验结果显示,黄芩回流提取的影响因素有：乙醇浓度、提取时间及溶剂用量。数据结果在模型拟合中,回归在处理非连续变量时比较困难,根据实际情况,把提取次数(非连续变量)暂定为1次。根据星点设计的原理,每因素设五水平,用代码值-α、-1、0、1、α来表示(三因素星点设计的α＝1.732)。代码值所代表的实际操作物理量见表1,试验安排与结果见表2。表1 因素水平表（略）表2 星点试验设计与结果（略）注：黄芩的投料量为10 g,15～20号为重复试验,试验结果用平均值表示
2.2.2 模型拟合
以黄芩苷提取率为因变量对各因素进行多元线性回归和二项式拟合,用statistica软件,拟合模型如下。
多元线性回归：y＝b0＋b1x1＋b2x2＋b3x3
二项式拟合：y＝b0＋b1x1＋b2x2＋b3x3＋b4x12＋b5x22＋b6x32＋b7x1x2＋b8x2x3＋b9x1x3
据结果分析,多元线性回归r＝0.909,f(3,11)＝17.66,p＜0.00016＜0.01。虽然模型通过检验,但拟合度不佳,预测性较差,因此线性模型不合适,采用二项式拟合(见表3)。模型复相关系数r＝0.977 04,剔除最不可信的b7、b9项,再重新拟合(见表4)。表3 二次多项式非线性估计结果（略）表4 简化后二次多项式非线性估计结果（略）
二项式数学模型：y＝-12.964 2＋0.180 78x1＋8.505 4x2＋1.924 6x3－0.001 8x12－4.289 6x22－0.480 2x32＋2.046 5x2x3 。
复相关系数系数r＝0.975 9,与线性拟合相比有较大提高,简化的方程r值降幅很小,说明此方程有较高的可信度。
2.2.3 工艺参数优化和预测
把因变量与另两因素拟合为三维曲面图,因只能表达含2个因素变量的函数,故固定3个变量中的1个为中值,再以拟合的目标函数为数学模型,绘制因变量曲面图(图略),在图上选取提取含量较佳工艺范围：x1为45%～55%；x2为90 min～120 min；x3为4～6倍,考虑到工业生产中的实际情况,选取最优工艺为：4倍量40%乙醇回流提取120 min。
根据以上条件试验(投料量10 g,45%乙醇4倍量,回流提取120 min),提取率预测值为7.77%,真实值为7.6%。偏差率＝(7.74%－7.77%)/7.77%×100%＝-3.86%。表明所建立的数学模型具有良好的预测性,所选工艺条件重现性好。
3 讨论
郝氏等[1]研究表明,乙醇回流提取黄芩的最佳条件是40%乙醇、10倍量溶剂、回流提取1 h；唐氏等[2]的研究最优条件是50%乙醇；熊氏等[3]用乙醇回流提取最佳条件是60%乙醇、10倍量溶剂回流提取3次、每次1 h。可见,在不同的研究结果之间存在着差异。可能是除黄芩提取的多个因素之间共同作用之外,各因素间还存在相互作用影响试验结果。由于试验设计及试验结果的处理方法不同,结论的准确性有所不同。
本试验采用了星点设计,其充分考虑到各因素间的相互作用,且设计方法简单,试验次数少,在中心点进行重复性试验以提高试验精度。同时采用非线性数学模型拟合,复相关系数较高,可信度较好,预测值更接近真实值。与正交及均匀设计相比,星点设计所得的结果更加直观,便于分析,同时提高了精确度。
【参考文献】
[1] 郝治湘,邬洪源,周 萍,等.黄芩苷提取工艺的研究[j].齐齐哈尔大学学报,2004,20(4)：21－23.
[2] 唐海燕,牛雪平,卢慧斌,等.黄芩中黄芩甙的提取工艺研究[j].内蒙古大学学报,2004,35(3)：355－357.
[3] 熊淑华,熊爱珍,方 晓,等.正交试验设计法优选黄芩的提取工艺[j].中国医药导报,2008,5(2)：46－47.
