【摘要】 目的探讨黑质部位注射fecl3制备帕金森病模型的可行性，并观察黄芩苷的保护作用。方法雄性wistar大鼠，黄芩苷组术前灌胃黄芩苷（78 mg·kg1·d-1）1周；模型组和黄芩苷组均单侧黑质定向注射fecl3(40μg)造摸,术后第5周中脑黑质病理切片行免疫组化分析酪氨酸羟化酶（th）；铁染色观察中脑黑质铁含量。结果①造模后2～3 d，动物头、身体向注射对侧倾斜，部分动物自发向注射对侧旋转，有些伴有抽搐和强直。术后7 d尚见有不同程度类帕金森病表现，震颤、弓背；黄芩苷组死亡率（模型组46%，黄芩苷组36%）降低。②注射侧中脑见明显的铁沉积,脑组织损毁严重。而黄芩苷组未见这一现象。③注射侧黑质多巴胺能神经细胞明显缺失。黄芩苷预防给药1周没能阻止这种损伤。结论铁剂黑质注射造成的中脑损毁严重，动物有类帕金森病表现。黄芩苷能阻止铁在中脑沉积及所造成的损毁，显示明显的保护作用。
【关键词】 三氯化铁； 帕金森病； 帕金森模型； 黄芩苷
chinaabstract：objectiveto explore the feasibility of developing parkinson's disease model induced by injecting fecl3 into nigrostriatum, and to observe the protective effect of baicalin on the model.methodsthe wistar rats of druggroup were administered baicalin (78mg·kg-1·d-1) by oral for 1 week. the fecl3 (40μg) was injected into the unilateral substantia nigra (sn) on all rats. the dopamine neurons at the mesencephalon nigra were observed by tyrosine hydroxylase (th) immunohistochemistry in the 5th week after injection. the iron contents were measured by iron stain. results①the head and body of animals was gradient toward side of the opposite injected mesencephalon after operated for 23 days, spontaneous rotation behaviors toward the opposite side of injected side and convuision and tetany for some rats. some similar parkinson's disease behavior appeared, such as thrill, hunchback on the 7th day after injection, mortality were reduced in rats of baicalingroup rats. ②iron deposit in the nigrostriatum and lesions of the mesencephalon appeared on injected side in the modelgroup, but it weren't in rats of baicalingroup. ③the nigrostriatal dopaminergic neurons were decreased on injected side and this decrease could not be prevented by baicalin treatment prior 1 week.conclusionthe lesion of the mesencephalon induced by fecl3 injection is severe, and some similar parkinson's disease behaviors can appeare.the results we report here offered support that the protective effect of baicalin on iron gather and mesencephlalon lesion induced fecl3 injection in rats.
key words： parkinson's disease；parkinson's disease model；baicalin
帕金森病(parkinson's disease, pd) 是常见的神经退行性疾病。wwW.11665.cOM研究证明pd患者黑质内铁含量异常升高是帕金森病一个共有而不变的特征；不仅脑内铁代谢紊乱，流行病学调查还显示其全身铁代谢也遭到破坏［1］。研究提示铁直接参与pd的神经变性改变。铁代谢紊乱、铁诱导的氧应激自由基生成增加是pd发病中的重要环节，与导致pd患者氧化应激状态及黑质损伤密切有关。铁螯合剂在动物实验中显示出显著的疗效，动物在用6ohda处理之前给予铁螯合剂去铁胺可明显减轻6ohda诱发的黑质多巴胺能神经变性［2］。铁螯合剂在治疗pd中的潜能使它已成为寻找抗pd新药关注的方向之一。
黄芩苷是中药黄芩中提取的黄酮类有效成分。体内外的实验都证明它有显著的抗氧化性，减轻脑组织和心肌组织的缺血再灌注损伤［3］；能减少谷氨酸和过氧化氢对离体神经细胞的损害［4］；对局灶性脑缺血大鼠的神经功能有保护作用 ［5］。黄芩苷结构的特殊性使它能和金属离子产生强烈的螯合作用［6］。本研究探讨脑内注射铁剂制备帕金森病模型的可行性，同时观察黄芩苷对黑质部位注射铁剂所造成损毁的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组、给药及处理健康雄性wistar大鼠［购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：scxk（京）20070001］26只，体质量250～300 g，随机分为3组，模型组13只，黄芩苷组11只, 该组手术前灌胃黄芩苷(78mg·kg-1·d-1［7］，四川广汉市本草植化有限公司产品，批号：030812)1周。2只为假手术对照。模型组和黄芩苷组均施予fecl3脑内定位注射，假手术组除注射外均与其他组相同处理。各组手术后饲养5周，期间记录大鼠行为学变化并拍摄摄像，实验结束时各组取2只做病理的动物麻醉后开胸，行多聚甲醛心脏灌注固定，24 h内制作中脑黑质部位冰冻切片（片厚50μm），以备做免疫组化分析和铁染色。其余动物断头处死，迅速冰盘上分离纹状体、中脑黑质、海马、大脑皮层及其余脑组织置-80℃保存。
1.2 黑质内定向注射fecl3［2］大鼠用10%水合氯醛麻醉(0.35 ml/100 g)后固定于立体定位仪上，按照下列坐标将无菌fecl3 溶液(20 mg/ml)，分为两点(每点1μl)缓慢注射至左侧黑质中：作标为①门齿棒上2.4 mm，前囟下4.4 mm，中线旁开1.1 mm，颅骨下7.9mm；②门齿棒下3.4 mm，前囟下4.0 mm，中线旁开0.8 mm，颅骨下8.1 mm。大鼠铁剂总量为40 μg。
1.3 黑质酪氨酸羟化酶（th）免疫组化染色各组做病理的大鼠脑切片在0.01 mol/l pbs液中浸洗2 min×3次；室温入1n盐酸抗原修复30 min，蒸馏水浸洗3 min×3次；再入3%h2o2消除内源性过氧化物酶的活性10 min，蒸馏水浸洗3次， 0.01mol/l pbst浸洗0.5min×2 次；入5%正常羊血清封闭30 min，倾去血清后直入适当稀释的ⅰ抗（大鼠单克隆th抗体 ,sigma）室温过夜；0.01 mol/l pbs液中浸洗2 min×3次；入1：300生物素标记的ⅱ抗(羊抗小鼠igg，北京中山金桥生物技术有限公司)室温23h，0.01 m pbs液中浸洗2 min×3次。入1:300辣根酶标记的链霉卵白素（ⅲ抗）2～3h，再入0.01 mol/l pbs液中浸洗2 min×3次，每次；dab显色10～30min。然后入水充分浸洗。裱片，自然干燥。
1.4 铁染色［7］脑切片置于含4%多聚甲醛的pb液中5 min，蒸馏水冲洗30s，新鲜配置的2% hcl与2%亚铁氰化钾等体积混合液30 min，pbs冲洗5 min×2次， 1% h2o2甲醇溶液20 min，pbs冲洗5 min×2次，dab显色，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。
1.5 病理分析每只动物的多张脑切片，nikon显微镜（eclipse80i）下取3～4个黑质区域用niselements 病理图像分析系统进行分析，数据均采用±s表示，统计分析采用spss 11.5进行，p＜0.05则具有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学观察术后2～3 d，动物表现为头、身体向右侧倾斜，竖毛，有些出现对侧旋转或同侧旋转。有些伴有抽搐，进食和饮水减少，体重明显下降，当握住鼠尾提起时出现大鼠头朝向对侧弯曲身体。术后7 d左右，模型组的动物有不同程度的类帕金森病症状表现，震颤、弓背、身体向一侧倾斜，旋转，不能走直线；而黄芩苷组的动物较之模型组，以上症状均较轻。术后2～5周，各组动物均可以自主进食饮水，体重基本恢复到术前水平，身体仍向右侧倾斜,有些仍有弓背并不时伴有抽搐。黄芩苷组黑质注射铁剂后的死亡率降低（黄芩苷组36.36%，模型组46.15%）动物整体的状况有所改善。
2.2 铁染色结果模型组注射侧中脑见到明显的铁沉积,针孔周围脑组织损毁严重(见图4与图6比较) ,黑质部位注射侧铁染色阳性细胞数明显高于对侧(见表1),甚至有些部位可见注射侧中脑结构塌陷(见图1),应是铁的毒性所造成的脑组织破坏所致。而黄芩苷组未见到中脑铁的沉积，也未见到组织损毁（见图5）, 黑质部位注射侧铁染色阳性细胞数明显高于对侧(见表1)。提示黄芩苷能够通过某种途径对抗、阻止注射的铁在中脑的沉积及所造成的损伤。
2.3 th染色结果有些切片见注射侧黑质多巴胺能神经细胞明显出现缺失（见图1），对侧较注射侧明显减轻（图2与图3比较）,但各组多张切片的图象分析结果显示注射侧th染色阳性细胞与未注射侧没有明显差别。见表1。表1 各组黑质酪氨酸羟化酶(th)染色和铁染色图象分析（略）
3 讨论
pd患者黑质铁含量升高的原因以及铁超载在发病过程中的作用尚未完全阐明。目前的看法认为黑质内过量的活性铁可作为一种神经毒素通过多种途径诱导氧化应激，生成细胞毒性的羟自由基，引发膜脂质过氧化，损伤神经细胞而最终导致细胞死亡［8］。有关铁促进黑质da能神经元变性的证据大多是间接的，有报道指出［9］，pd患者血液及脑脊液中的游离铁含量并未升高，血液中的铁蛋白、转铁蛋白及乳铁蛋白与对照人群比较亦无显著差异。有研究发现患者黑质乳铁蛋白及其受体选择性增加，提示局部铁代谢异常可能与黑质铁增高有关。有学者认为黑质铁含量增加可能只是神经变性的一种继发性改变，铁超载不可能是pd发病始动因素［10］。但铁作为一种强力自由基生成催化剂可能在da能神经元变性某些中间环节起重要作用。
以往的研究证实铁剂可导致大鼠黑质da能神经元变性丢失，纹状体多巴胺含量选择性降低［11～13］本研究也观察到大鼠黑质da能神经元变性丢失,但脑内注射铁剂造成的损伤影响到中脑较多的区域。我们注意到，其对中枢神经系统的影响是剧烈而广泛的，行为学表现复杂，有些动物存在抽搐、强直等类癫痫发作症状，这证明铁离子在中枢神经内的大量增加所引起的损害涉及到的区域较广，选择性低。本研究中黄芩苷口服显示出对抗、阻止铁在中脑沉积的保护作用，动物行为学表现也显示改善，推测黄芩苷体内对铁离子可能有直接的螯合作用，我们在体外曾观察到黄芩苷能显著抑制fe2+半胱氨酸引起的小鼠肝微粒体脂质过氧化反应，当体系中铁离子浓度增加时抑制作用减弱，证明黄芩苷与铁离子的相互作用能影响脂质过氧化的水平［14］。本研究的结果从整体水平证实黄芩苷对脑内铁损毁的保护作用，为其可能作为铁螯合剂辅助治疗pd的价值提供了初步的实验依据。
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