作者：张燕萍，张元元，苗青，王书臣，谭素贞
【摘要】 目的初步探讨益肾平喘活血合剂对哮喘气道重塑大鼠血清及气道上皮炎性因子的影响。方法sd大鼠60只，随机分为正常组，造模组，激素组和中药高、中、低剂量组各10只。按文献方法制成支气管哮喘模型。用放免法测定血清il-2、il-4浓度，免疫组化法测定大鼠气道tgf-β，苦味酸天狼星红染色，观察气道胶原分布和变化。结果①与正常组比较，中药3个组血清il-2水平下降，il-4水平升高均轻于造模组和激素组，与造模组比较有显著差异（p<0.01），与激素组比较无显著差异（p>0.05）；中药组组间比较，高、中剂量组优于低剂量组（p<0.05）。②tgf-β免疫组化造模组阳性反应最强，呈深棕色，激素组，中药3个组阳性反应稍弱，呈棕黄色至浅黄色，正常组呈淡浅黄色。③苦味酸天狼星红染色，偏振光显微镜观察，造模组支气管粘膜及上皮下ⅰ型和ⅲ型胶原纤维明显增多；激素组较造模组减少，中药低剂量组改变与激素组类似，中药中、高剂量组胶原纤维沉积少于激素组；正常组可见少量胶原纤维分布。结论益肾平喘活血合剂治疗哮喘慢性持续期的作用途径，可能有一部分是通过调节il-2、il-4、tgf-β水平，减少气道壁胶原等来延缓支气管哮喘气道重塑的形成。WwW.11665.coM
【关键词】 支气管哮喘； 气道重塑； 炎性因子
chinaabstract：objectiveto investigate the effect of yishenhuoxue decoction on serum inflammation factor of bronchus asthma airway remolding model.methodssixty sd rats were randomly divided into six groups: blank group,asthma group,hormone group, and high, middle and low dosage chinese medicine groups, 10 rats in each group.the asthmatic model was established by sensitization and challenge with ovalbumin.radioimmunoprecipitation was used to determine the contents of serum il-2, il-4. elisa was used to measure the level of serum tgf-β. picric acid sirius red dyeing was used to observe the dostritmtion and change of collagen in the rat airway. results(1) compared with the blank group, serum il-2 was descreased, and il-4 was increased in other five groups. the change of rat's serum in the three chinese medicine groups was smaller than in the asthma group and hormone group. the levels of serum il-2, il-4 among chinese medicine groups and the asthma group were different. （p<0.01）. they were similar among the chinese medicine groups and hormone group （p>0.05）the high and middle dosage groups were better than the low dosage group （p<0.05）.(2) the positive reaction of serum tgf-β in the asthma group was the strongest, deep brown look. the positive reaction of serum tgf-β in the hormone group and the chinese medicine were much lighter, brown and buff look.the blank group looked like pale buff color. (3)in picric acid sirius red dyeing and polarizable optic microscope, tapeⅰand tape ⅲ collagen in bronchus mucous membrane and under the epidermis of the asthma group increased obviously. the change of chinese low dosage medicine group and the hormone group were smaller, which were less than the asthma group. in the chinese middle and high dosage medicine groups , the collagen textile fiber was less than the hormone group. there was a little collagen textile fiber in the blank group. conclusionyishenhuoxue decoction may control the level of rat serum il-2 , il-4 and tgf-β in the bronchus asthma airway remolding model, reduce the collagen in the cliff of the airway, which may slow the remodeling of bronchus in asthma rats.
key words：bronchus asthma ; airway remolding ; inflammation factor
益肾平喘活血合剂是我院呼吸科治疗支气管哮喘的常用方剂，在临床上取得了较好的疗效。我们建立了大鼠支气管哮喘模型（以下简称哮喘模型）以观察其气道重塑的改变。通过益肾平喘活血合剂对其干预，初步探讨益肾平喘活血合剂治疗哮喘慢性持续期的作用途径，观察其对与哮喘气道重塑密切相关的血清白细胞介素－2（il-2）、白细胞介素－4（il-4）与大鼠气道上皮转化生长因子-β（tgf-β）表达的影响，为临床应用提供可靠的理论基础。
1 材料与仪器
1.1 动物健康雄性sd大鼠，体质量(200±10)g ，60只。北京维通利华实验动物技术有限公司提供［许可证编号：soxk(京)2002－0203］。
1.2 药品卵蛋白（ovalbumin ova）gradeⅱ，购于sigma公司；灭活百日咳杆菌苗购于北京生物制品研究所；氢氧化铝购于北京市化学试剂公司（批号 20040618）；3.5%水合氯醛，（批号 20050916）西苑医院制剂室提供；泼尼松购于天津力生制药股份有限公司（批号0410086 ）；血清il-2、il-4放免试剂盒购于北京华英生物技术研究所（批号20040625 ）；免疫组化试剂盒（sp-9001）美国zymed公司；浓缩型dab试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；tgf-β抗体，美国santa cruz生物技术公司益肾平喘活血合剂［补骨脂、生地、 川芎、赤芍、炙麻黄、杏仁、穿山龙、茯苓、甘草，由中国中医科学院西苑医院制剂室制备（批号 20050321）］，1ml药液≈4 g生药量，再根据实验要求进行稀释）。
1.3 仪器402型医用雾化器，上海合力医疗器械厂生产；80－2台式离心机，上海医疗器械厂生产；全自动ria16γ免疫计数器，美国capintec公司生产；石蜡切片机，德国leica公司生产；图像分析系统，德国leica-q550cw;偏振光显微镜，德国nikon公司。
2 方法
2.1 大鼠分组及哮喘模型的建立哮喘模型的建立：参考temelkovski等［1～3］的方法，配置成每毫升含ova 100 mg、al(oh)3 100 mg、灭活百日咳杆菌约6×109个的溶液。第1步致敏：第1天每只大鼠腹腔注射以上溶液1 ml，第8天重复腹腔注射1 ml。第2步激发：第15天将致敏大鼠置于密闭喷雾箱，给予10g/l的ova生理盐水溶液，超声雾化，每天激发20 min，连续14 d，制成支气管哮喘模型。
60只大鼠随机分为6组，在中国中医科学院西苑医院二级动物室［饲养设施合格证号syxk(京)2003－0008）开始实验］适应性喂养1周后开始实验。分组：正常对照组（正常组）：腹腔注射及雾化均用生理盐水，每天雾化吸入前20 min用2 ml生理盐水灌胃。空白造模对照组（造模组）：ova造模后，每天激发前20 min用2 ml生理盐水灌胃。激素对照组（激素组）：ova造模后，每天激发前20 min用2 ml泼尼松溶液灌胃（每日泼尼松0.3 mg/100 g体质量）。中药实验组（中药低、中、高剂量组）：ova造模后，每天激发前20 min用2 ml益肾平喘活血合剂灌胃（每日分别按低、中、高剂量组予0.45，0.9，1.8 g生药量/100 g体质量）。
2.2 标本的采集各组大鼠在末次激发后24 h内收集标本，用3.5％水合氯醛（1 ml/100 g体质量）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，静置1 h后，离心机(2 500 r/min)离心15 min，分离血清，分别用放免法按il-2、il-4试剂盒使用说明即刻检测。免疫组化abc法测定tgf-β的表达；用leica－q550cw图像分析系统测定样品中ⅰ型、ⅲ型胶原的相对含量，在光镜下（×200）随机取4个单位面积，每组共测24个单位面积，分别测定平均光密度值（od值）、阳性区域面积（μm2），并计算积分光密度=od值×阳性面积。
2.3 统计学处理上述数据统计分析采用spss10.0统计分析软件进行计算，数据以±s表示，两两比较采用t检验、组间比较采用方差分析， p<0.05有显著性差异，p>0.05无显著性差异，p<0.01有高度显著性差异。
3 结果
3.1 体征及肺组织形态学观察正常组大鼠呼吸平稳，行动灵活，反应灵敏，体质量稳定增长，毛色光泽。造模组出现呼吸急促，轻度紫绀，行动迟滞或俯伏不动，反应迟钝，体质量减轻，毛色失去光泽。激素组、中药组大鼠体质量增长低于正常组，其它体征变化不明显。肺组织形态学见模型组气道管壁、肺泡隔、气道平滑肌增厚，粘膜下、管壁及肺泡间质均有大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润，管腔狭窄。
3.2 放免法测定血清il-2、il-4（见表1）。在哮喘持续发作时，大鼠血清中il-2水平下降，il-4水平升高。与正常组比较，中药3个组的血清il-2水平下降，il-4水平升高均轻于造模组和激素组；与造模组比较有显著差异（p<0.01），与激素组比较无显著差异（p>0.05）；中药组组间比较，高、中剂量组优于低剂量组（p<0.05）。表1 各组大鼠血清il-2、il-4水平比较（略）
3.3 免疫组化abc法测定大鼠tgf-β的表达见表2。tgf-β免疫组化造模组反应最强，呈深棕色；激素组及中药3个组阳性反应稍弱，呈棕黄色至浅黄色，正常组呈淡浅黄色。以上结果经图像分析，统计学处理得到光密度值（od值），各组与正常组比较无显著性差异（p＞0.05），各组与造模组比较有显著性差异（p<0.05～0.01），中药高剂量组与激素组比较有显著性差异（p<0.05）。表2 各组大鼠tgf-β的表达水平比较（略）
3.4 气道胶原分布和变化采用苦味酸天狼星红染色，偏振光显微镜观察，造模组支气管粘膜及上皮下ⅰ型和ⅲ型胶原纤维明显增多；激素组较造模组减少，中药低剂量组改变与激素组类似，中药中、高剂量组胶原纤维沉积少于激素组；正常组可见少量胶原纤维分布。
4 讨论
气道重塑(airway remolding) 是支气管哮喘慢性持续期除了气道炎症和非特异性气道高反应性外，还存在的特征行性的气道结构改变。气道重塑包括基底膜胶原过度沉积，上皮尤其是杯状细胞增生并粘液高分泌，平滑肌增生肥大，肌成纤维细胞增生，被认为是造成难治性哮喘的根本原因。
本实验模型大鼠肺组织出现了典型的炎症改变，粘膜下、管壁及肺泡间质均有大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润，血清中细胞因子发生改变，il-2水平下降，il-4水平升高，造模组改变最明显，中药组减轻。这种变化将进一步引起嗜酸性粒细胞的活化与浸润，嗜酸性粒细胞又是tgf-β的主要来源之一。实验结果可见：造模组气道粘膜上皮组织、肺泡巨嗜细胞及间质细胞都出现了tgf-β的强阳性反应，中药组表达反应减弱。tgf-β是哮喘气道重塑的主要调控因子［2］，可以促进纤维化，刺激纤维母细胞合成和分泌细胞外基质，如ⅰ型和ⅲ型胶原，使纤维母细胞转化为肌成纤维细胞。通过苦味酸天狼星红染色，造模组ⅰ型和ⅲ型胶原纤维明显增多，中药组气道壁胶原明显减少。
哮喘慢性持续期的气道重塑在临床上的表现有胸闷、憋气、胸痛，面色晦暗，口唇发绀，舌质暗红，或有瘀点或瘀斑等症状，为哮喘久病所导致的本虚标实，肺脾肾虚，肺气不宣、痰瘀阻络［3］。中医药在治疗支气管哮喘慢性持续期的临床实践中具有良好疗效和丰富的经验。益肾平喘活血合剂是我们应用多年的有效方药。方中补骨脂辛温，归肾经，温肾平喘；生地甘寒补肾阴；共为君药。川芎辛温，为血中气药，活血行气；赤芍凉血活血，与川芎相须为用。炙麻黄宣肺平喘，杏仁降气止咳；穿山龙活血通络，清肺化痰；茯苓健脾化痰共为臣药。炙甘草补脾益气止咳，调和诸药，是为佐使。诸药合用益肾健脾，宣肺化痰，活血行气。气机通畅，喘哮自平。
本研究通过建立支气管哮喘气道重塑大鼠的模型，测定了大鼠血清il-2、il-4的浓度，发现哮喘造模组的血清il-2水平下降，il-4水平升高明显异于正常组、激素、中药组，说明支气管哮喘确实存在血清il-2、il-4水平的改变。糖皮质激素是最有效的治疗哮喘的药物，本实验也证实糖皮质激素的干预能调节血清il-2、il-4浓度，益肾平喘活血合剂具有与其相似的效果。
综上所述，益肾平喘活血合剂治疗哮喘慢性持续期的作用途径，可能有一部分是通过调节il-2、il-4、tgf-β水平，减少气道壁胶原等来延缓支气管哮喘气道重塑的形成，对哮喘的预防及治疗将是一种新的途径。
【参考文献】
1］施新献.现代医学实验动物学，第1版［m］. 北京：人民军医出版社，2000：9.
［2］王忆勤，李福风，滕忠照，等.支气管哮喘大鼠气道重建特征的研究［j］.中华结核和呼吸杂志，2003，26（11）：728.
［3］王文建，杨 莉，王西华，等.川芎嗪对大鼠支气管哮喘模型气道重塑的影响及机制［j］.中华结核和呼吸杂志，2004， 27（12）：833.
