作者：刘小辉,郭立玮,潘林梅,沈强
【摘要】 目的 优选补精益肾颗粒的最佳提取工艺。方法 采用正交试验设计,以淫羊藿苷的提取率作为评价指标,分别对影响提取效果的加水量、提取时间以及提取次数3个因素,选择3个水平进行考察。结果 最佳提取工艺为提取2次、加水量分别为10倍量和8倍量、提取时间各为1.5 h。结论 该工艺稳定可行。
【关键词】 补精益肾颗粒；正交设计；淫羊藿苷
abstract：objective to investigate the process of best extraction for bujing yishen granules. methods the orthogonal test was employed for selecting the best extraction process, with the extraction rate of icariin as criteria. the levels of water amount, extracting time and times were studied. result the super extraction process was adding 10 times amount of water and 1.5 hours for the first time, then adding 8 times and 1.5 hours for the second time. conclusion the method is stable, reasonable and feasible.
key words：bujing yishen gramule；orthogonal design；icariin
补精益肾颗粒是由淫羊藿、太子参等药味制成的中药复方制剂,具有补气健肾之功效,临床主要用于治疗男性不育症。wWW.11665.cOM淫羊藿为方中君药,主要含淫羊藿苷等黄酮类成分和多糖。鉴于淫羊藿苷等的有效成分极性较大,为保证该药中有效成分的提取,本制剂宜采用水煎煮方式提取。为优选其提取工艺,以提取液固形物得率和淫羊藿中淫羊藿苷作为指标,采用正交设计法对主要影响提取效果的加水量、提取时间、提取次数3个因素,选择3个水平进行考察。
1 仪器与试药
waters515双泵,2487双波长紫外检测器,wdl-95色谱工作站(大连化学物理研究所生产)。淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用,批号0737-200011),淫羊藿等处方中药材购于南京市药材公司,经南京中医药大学鉴定教研室吴启南教授鉴定,符合《中华人民共和国药典》(2005年版)有关规定。乙腈为色谱纯(德国merck公司生产),水为超纯水,其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 因素水平
对影响提取效果的加水量(a)、提取时间(b)、提取次数(c)3个因素分别取3个水平安排实验,因素水平见表1。选用l9(34)表进行试验安排,正交试验设计及结果见表2。表1 因素水平表（略）表2 水提取l9(34)试验表（略）注：淫羊霍苷提取率=(提取液中淫羊霍苷含量/投料药材中淫羊霍苷含量)×100%。
2.1.1 吸水率考察[1]
将淫羊藿等处方药材适当粉碎,称取处方一半量药材50 g(3份)混合,加水500 ml浸泡,隔一定时间观察浸透心程度。至全部透心时,吸水率为2%。
根据处方量称取淫羊藿、太子参等药材,共9份,每份重100 g,按表2安排试验,煎煮提取,每份提取液减压浓缩至约100 ml,精密移取10 ml置50 ml量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,采用淫羊藿苷的含量测定方法用hplc法测定。
2.1.2 水浸出物测定
精密量取上述正交试验的提取液20 ml,于干燥至恒重的表面皿(w1)中,在水浴上蒸干后转移至烘箱中,105 ℃干燥4 h后立即放到干燥器中30 min,冷却后,立即称重(w2),由下式计算(w为处方量药材重量,v为各正交试验提取液体积)。
水浸出物得率(%)＝(w2－w1)×v/(w×20)×100%
2.2 淫羊藿苷的含量测定
2.2.1 色谱条件[2-3]
色谱柱：lichrospher c18(4.6 mm×250 mm)；流动相：乙腈-水(28∶72)；流速：1.0 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；aufs＝0.5。
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称取105 ℃干燥至恒重的淫羊藿苷对照品5.06 mg,置于5 ml容量瓶内,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密吸取1 ml置于10 ml量瓶内,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为0.101 2 mg/ml淫羊藿苷对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备
按处方比例称取淫羊藿、太子参等处方中的药材共100 g,加水提取2次,每次提取1.5 h,合并2次提取液,提取液经过高速离心之后,精密吸取该提取液1 ml,置于5 ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
2.2.4 阴性对照试验
按处方比例称取除淫羊藿以外的药材,按“2.2.3”项下方法制备阴性样品液及阴性对照溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各5 μl,进样,按“2.2.1”项色谱条件测定,结果阴性无干扰。
2.2.5 线性关系考察
精密吸取淫羊藿苷对照品溶液2、4、6、8、10、12 μl,注入液相色谱器仪中,测定峰面积。以进样量为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,经线性回归,回归方程为：y＝5 864 392.0x－897.5,r＝0.999 4。由测定结果提示,淫羊藿苷进样量在0.202 4～1.214 4 μg范围内线性关系良好。
2.2.6 精密度试验考察
分别精密吸取同一供试品溶液5 μl,连续进样5次,结果所得淫羊藿苷含量的rsd＝1.58%。
2.2.7 重复性试验考察
取5份同一批样品,按供试品溶液制备方法制备,进行测定,结果,淫羊藿苷的平均含量rsd＝2.6%。
2.2.8 稳定性试验考察
取同一供试品溶液,按0、2、4、6、8 h时间间隔,分别进样分析,测定色谱峰面积,结果淫羊藿苷在8 h内稳定,rsd＝2.5%。
2.2.9 回收率试验考察
精密称取已测知淫羊藿苷含量的样品及一定量的对照品(共5份)按样品含量测定项下方法操作,结果淫羊藿苷平均回收率为99.7%,rsd＝2.6%。
2.2.10 样品测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μl,注入高效液相色谱仪,按外标法计算。
2.3 试验结果
(见表3、表4) 表3 浸出物得率方差分析表（略）注：f0.05(2,2)=19.00。表4 淫羊藿苷含量方差分析表（略） 注：f0.05(2,2)=19.00。
对正交试验所得结果作直观分析和方差分析,以判断各因素对提取效果的影响程度,筛选出在该试验条件下最优的提取条件。由水浸出物得率为考察指标,由表2中极差r值大小分析可知,各因素主次顺序为c>a>b；方差分析结果表明：只有c因素具有显著性意义(p<0.05),a因素和b因素对水提浸出物的得率没有显著性意义(p>0.05),a3b1c3为佳；以淫羊霍苷含量为考察指标,由表2极差r值大小显示,各因素作用主次为b>a>c。方差分析结果表明,a、b、c三因素均对淫羊霍苷含量的影响具有显著性意义(p<0.05),以a2b2c2组合为佳。考虑到淫羊霍苷含量这个指标更为重要,故选择a2b2c2为最佳工艺,提取2次、加水量分别为10倍量和8倍量、提取时间各为1.5 h。
2.4 验证试验
称取处方量药材按a2b2c2进行验证试验,结果与正交试验结果吻合,说明该工艺稳定可行。
3 讨论
采用正交设计试验法来优化中药制剂的提取工艺,可缩短试验周期,减少试验次数,且试验结果可比性强,可进行方差分析,具有很强的实用性。采用高效液相色谱法测定淫羊藿苷具有快速、准确、重复性好等特点并且含量测定结果比较可靠。正交试验考察指标采用淫羊藿中淫羊藿苷提取率为指标,侧重考察有效成分的提取效果,较以固形物得率为指标更为合理。故本试验在最终确定最佳工艺时也是这样取舍的。当然,鉴于目前中医药作用机理研究的不是很深入,因此,以后需要结合临床疗效进一步验证采用淫羊藿中淫羊藿苷提取率为指标并采用正交试验优选得到的工艺是否为最佳工艺。相信随着中医药现代化的深入发展,这些问题会得到很好的解决。
【参考文献】
[1] 谢秀琼.中药新制剂开发与应用[m].北京：人民卫生出版社,2002.135.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京：化学工业出版社,2005.附录33－34.
[3] 刘 霞,杨远明.hplc测定舒宁片中淫羊霍苷含量[j].中成药,2003, 25(11)：936－937.
