作者：侯巍，高金波，张云杰，孙丽娜，滕杨
【摘要】 目的探讨不同浓度的氮酮、丙三醇、油酸对大黄中蒽醌类有效成分透皮吸收的影响。 方法以离体小鼠皮为透皮屏障，采用改进franz扩散池装置，采用高效液相色谱法同时测定接收池中蒽醌类物质大黄素，大黄酚，大黄素甲醚，大黄酸的含量，计算累积透过量。结果氮酮、丙三醇和油酸对大黄中蒽醌类物质均有促透作用，其促透作用强弱顺序为：2%氮酮>1%氮酮>4%氮酮>6%氮酮；6%丙三醇>4%丙三醇>2%丙三醇>1%丙三醇；2%油酸>4%油酸>6%油酸>1%油酸。 结论 氮酮、丙三醇和油酸对大黄中蒽醌类物质大黄素、大黄酚、大黄甲醚、大黄酸的促透作用具有一定的量效关系。
【关键词】 透皮吸收；促进剂；大黄；蒽醌类；有效成分
abstract：objectiveto evaluate the effect of azone, propanetriol and oleic acid under different concentrations on transdermal absorption of effective components in anthraquinones from rhubard. methodsa piece of excised abdominal hairless mouse skin was set in a franz-type diffusion cell.penetrations of emodin, rhein, physcion and chrysophanol were detected by hplc and cumulative permeation(q) calculated.resultslaurocapram, propanetriol and oleic acid were found permeation enhancing effect to anthraquinones (emodin, rhein, physcion and chrysophanol) in rhubard. the permeation enhancing effect was 2% oleic acid >4% oleic acid >6%oleic acid >1% oleic acid; 2%laurocapram >1% laurocapram >4% laurocapram >6% laurocapram; 6% propanetriol >4% propanetriol >2% propanetriol >1% propanetriol. conclusionlaurocapram, propanetriol and oleic acid have permeation enhancing effect to anthraquinones (emodin, rhein, physcion and chrysophanol) in rhubard with dose-effect relationship.
key words：transdermal absorption; potentiation; rhubard; anthraquinones; effective components
大黄具有较强的抗炎、收敛止血等功效，被广泛用于治疗皮肤病、湿疹、丹毒等疾病以及化妆品中；临床上多用大黄粉或与其它药物配伍，以醋、植物油等调敷外用。wwW.11665.com透皮吸收制剂是一种新型药物剂型，具有可维持稳定的血药浓度、避免胃肠道酶解作用和肝脏的首过效应、降低药物的毒副作用、给药方便等优点，为目前最受青睐的四大类新型制剂之一［1］。皮肤表皮的角质层对大多数外用药物形成一道难以渗透的生理屏障，许多药物透过该屏障的速度都很慢［2］。克服皮肤的屏障作用，寻找促进药物透皮吸收的方法，使药物在一定时间内经皮渗透并达到治疗所需的血药浓度，成为透皮给药领域开发和研究的热点之一［3］，应用透皮吸收促进剂是增加药物透皮吸收的首选方法［4］。我们对大黄提取物中蒽醌类物质大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄甲醚等在常用的促透剂氮酮，丙三醇和油酸三种溶剂体系条件下的透皮吸收进行了实验研究，旨为大黄的合理设计和开发提供依据，并为大黄透皮制剂的合理设计和开发提供参考。现报道如下。
1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（美国安捷伦1100，包括真空在线脱气机，四元泵，自动进样器，紫外检测器等），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），分析天平（上海恒平科学仪器有限公司），df-101s恒温水浴磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司），franz扩散池（沈阳玻璃仪器加工厂）。
西域大黄（安国市京兴药业责任有限公司），大黄酚，大黄素，大黄素甲醚，大黄酸，芦荟大黄对照品（中国生物药物制品研究所），丙三醇（锦西化学试剂厂），油酸（国安恒业精细化工有限公司），氮酮（北京市德鸿盛生物化学科技有限公司），无水乙醇等均为分析纯试剂。
2 方法与结果
2.1 大黄中蒽醌类物质的提取与制备
大黄粉碎后，过筛，取50 g大黄粉末，用300 ml 95%乙醇，水浴恒温回流4次，0.5 h/次，回流时温度控制在79℃左右，合并回流液。用旋转蒸发仪对合并液进行浓缩至70 ml左右，回收乙醇，浓缩液再进行乙醚（100 ml）萃取3次，合并，温度控制在35℃左右，用旋转蒸发仪蒸去乙醚（回收）。液体变粘稠后，继续加热至50℃蒸干，得黄棕色固体，即蒽醌粗品。对粗品用碱溶酸沉法进行纯化，再离心，得黄棕色沉淀，阴凉、干燥处风干，得黄棕色晶体粉末（大黄总蒽醌），备用。
2.2 分析方法的建立与考察
2.2.1 色谱条件
据参考文献［15］设定标准曲线的测定条件如下：色谱柱为c18柱；流动相为甲醇-0.1%磷酸-水=425∶1∶75；检测波长438 nm；流速1.0 ml/min。大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚的分离情况见图1。
2.2.2 标准曲线
精密称取大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚对照品5.2，6.3，2.0，4.5 mg，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升分别含0.52，0.63，0.20，0.45 mg的对照液，再吸取各对照品液1 ml，用甲醇定容于10 ml量瓶中。0.45 μm的滤膜过滤后，分别进样1，5，10，15，20，25 μl。以对照品进样量为纵坐标（y），峰面积分值为横坐标（x）绘制工作曲线，大黄酸：y=0.0371x+0.012 9（r=0.999 9）；大黄素：y= 0.009 1x-0.013 3（r=0.999 9）；大黄酚：y=0.008 1x+0.032 （r=0.999 9）；大黄素甲醚：y=0.013 2x+0.024 5（r=0.999 9）。
2.2.3 精密度实验
精密吸取大黄蒽醌混合液20 μl，在“2.2.1”项的色谱条件下，连续进样5次。rsd%分别为大黄酸0.13，大黄素0.11，大黄酚0.11，大黄素甲醚0.08。
2.2.4 稳定性实验
精密吸取大黄蒽醌对照混合液20 μl，分别在0，1，2，6，12 h进样，按色谱条件测定，测定结果大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的rsd分别为0.50%， 0.69%， 0.60%，0.57%。说明大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚非常稳定。
2.2.5 重复性实验
取约12 mg大黄蒽醌5份，用甲醇适当稀释后，用0.45 μm的滤膜过滤，进样20 μl，测定大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，结果rsd%分别为0.62，0.55，0.64，0.45。
2.2.6 回收率实验
精密吸取大黄蒽醌10 μl与对照品混合液4，6，8，10，12，16 μl混合，并用甲醇补充至20 μl后进样测定，计算得大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均回收率分别为100.6，100.7，100.2，100.0。
2.3 体外透皮吸收实验
2.3.1 离体鼠皮的制备
取质量为50～100 g 的小鼠，断颈处死，剃去腹部的毛，剪下皮肤，去除皮下组织，用生理盐水反复多次冲洗，置于-40℃的冰箱中保存。
2.3.2 大黄蒽醌的体外透皮吸收实验
体外渗透扩散装置恒温槽中加入适量水，设定恒温槽中水温为（37±0.1）℃。向垂直扩散池的接收池内加入16.5ml接收液（30%的乙醇，ph=6.0），进行预热，设定接收池搅拌速度为400 r/s。将鼠皮用铁夹子固定在两室之间，向供给池内加入已配好的供试液10 ml（取大黄总蒽醌480 mg，用甲醇定容至100 ml）。分别于0.5，1，2，4，6 h从接收池取样1 ml，同时向接收池中补充等量的接收液。用0.45 μm滤膜过滤，进样20 μl测定。按下式计算累积透过量（μg·cm-1）。
q=cn×5+n-1i=1ci×4a
其中，cn为第n个取样点的药物浓度（μg/ml），ci为第i个取样点的药物浓度，a为扩散面积。以累积透过量q对时间t进行作图，取曲线前端的直线部分进行线性回归，所得方程的斜率即为透皮速率。结果大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的透皮速率分别为：0.142，0.109，0.047 4，0.040 6。6 h时累积透过量（μg/cm2）分别为： 0.918，0.704，0.410，0.304。
2.4 促透剂的促透作用的研究
2.4.1 促透剂的制备
丙三醇，氮酮，油酸分别用50%的乙醇配制成浓度为1%，2%，4%，6%的溶液10 ml作为促透剂。
2.4.2 促透剂作用下的体外透皮吸收在改良franz扩散池恒温槽中加入适量水（37±0.1）℃，在接收池中加入16.5 ml 30%的乙醇（ph=6.0），将鼠皮用铁夹子固定在两室之间，向供给池内加入已配好的不同浓度的促透剂2.0 ml和供试液8.0 ml。于0.5，1，2，4，6 h分别取样1 ml，同时向接收池中补充等量的接收液。用0.45微孔滤膜过滤，进样20 μl测定峰面积，并计算按照下式计算大黄素，大黄酚，大黄素甲醚的累积透过量q，不同浓度的氮酮、丙三醇、油酸对大黄蒽醌增强作用的结果见图3～5。
结果显示出促进剂对它们的吸收均有一定的促透作用，总的趋势为，氮酮：2%>1%>4% >6%，丙三醇：6%>4%>2%>1%，油酸：2%>4%>6% >1%。
3 讨论
多数文献报道，hplc法测定蒽醌类常选用的检测波长在254 nm，但我们根据大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄甲醚的紫外光谱实际扫描结果，确定为438 nm为测定波长，在此波长下它们均有较强的吸收，而且干扰小，灵敏度较高，可满足透皮吸收对各组分的检测。
传统外用法中中药多以醋调外敷现代科学研究证实，醋中的醋酸、乳酸、氨基酸、甘油等化合物，对皮肤有柔和的刺激作用，使小血管扩张，增加皮肤的血液循环。另外本实验结果显示，在ph=6.0的30%乙醇溶液中有利于蒽醌类药物成分的穿透性，这可能与皮肤的生理特性有关。
关于大黄透皮吸收的研究中，现有的报道均对大黄中的大黄酚进行检测，而忽略了大黄中的其他有效成分。所以，本实验检测指标较多，同时对其大黄酸、大黄酚及大黄素甲醚等进行了透皮吸收的考察，以求得全面科学地探究透皮吸收及其促透作用情况。
本实验通过对大黄中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的体外渗透实验和促透剂对药物渗透的作用研究，得出以下结论：大黄中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的透皮吸收均有一定的促透作用，其中以大黄酸的透皮速率最好。在考察浓度为1%，2%，4%，6%的氮酮、丙三醇、油酸3种促透剂的促渗性能中，以浓度为2%氮酮时具有最大的透皮速率；丙三醇的促渗性能是随着浓度的增加一直呈现增强的趋势；油酸浓度为2%时与氮酮一样也有最大的透皮速率。
【参考文献】
［1］徐铮奎.四大类新型给药技术未来唱主角［j］.中国药业，2001，10(7):29.
［2］毕殿洲.药剂学，第4版［m］.北京:人民卫生出版社，2001:429.
［3］周运琴.透皮给药系统新方法及新技术的研究进展［j］.天津药学，2001，13(2):5.
［4］方晓阳，叶 青.中药透皮吸收促进剂的研究与发展［j］.中草药，2003，34(2):188.
