作者：刘强，揭春，何文，吴培华，宋金春
【关键词】 体外透皮试验
摘要:目的 考察透皮吸收促进剂对甲氧沙林脂质体(lmop)凝胶体外透皮作用的影响。方法 分别制备无透皮促进剂的lmop凝胶及以1%(ω)氮酮和1%(ω)丙二醇为透皮吸收促进剂的lmop凝胶。采用franz扩散池，以离体小鼠皮肤为透皮屏障，用高效液相色谱法测定体外接受液中甲氧沙林(8-mop)的含量，计算其累积透皮释药量（q），并将数据进行释放动力学模型拟合。结果 样品凝胶体外释药符合higuchi方程，不含透皮吸收促进剂的lmop凝胶：q = 79.65 t1/2+ 27.99；含透皮吸收促进剂的lmop凝胶：q = 117.39 t1/2+ 34.37，显示后者的渗透作用更好。结论 以1%(ω)氮酮和1%(ω)丙二醇为透皮吸收促进剂的脂质体凝胶的透皮渗透效果更佳。
关键词:甲氧沙林；脂质体凝胶；透皮吸收促进剂；体外透皮试验
abstract: objective to evaluate the effects of skin permeation enhancers,1% (ω)azone and 1% (ω)propylene glycol,on transcutaneous absorption of 8methoxypsoralenliposome gel. methods gels of 8methoxypsoralenliposome with and without skin permeation enhancers were prepared. a piece of excised abdominal hairless mouse skin was set in a franztype diffusion cell. penetration of 8methoxypsoralen was detected by hplc and cumulative permeation (q) calculated and simulated in pharmacokinetics model. results the drug release and permeation studies in vitro in franz diffusion cell followed the higuchi equation with optimum correlation coefficient. for the gel without enhancers,equation was as following:q=79.65t1/2+27.99; for the gel with enhancers,equation was as following:q=117.39t1/2+34.37. conclusions 8methoxypsoralenliposome gel with 1%(ω) azone and 1%(ω) propylene glycol has a higher permeation rate than the gel without enhancers.
key words:8methoxypsoralenliposomal gel; skin permeation enhancer; transcutaneous absorption in vitro
甲氧沙林（8methoxypsoralen，8mop）为治疗白癜风的国家基本药物。www.11665.cOm临床上应用的片剂、酊剂等传统剂型在长期使用后，易产生较严重的不良反应［1］。实验已证实［2］，甲氧沙林脂质体（methoxypsoralen liposome， lmop）凝胶剂以其可生物降解、皮肤靶向性强的特点，可减少药物全身吸收所带来的不良反应，具有较好的皮肤靶向性和缓释作用，且对实验性白癜风疗效明显优于同剂量的8mop酊剂及普通凝胶剂。
皮肤角质层是药物经皮吸收的主要屏障和限速部位,但脂质体能否顺利完全的透过皮肤角质层目前仍存有疑问［3］。而透皮促进剂能够增加药物的经皮渗透能力，减少时滞，提高药物生物利用度。因此，本文根据预试验结果并参考有关文献［4,5］，将氮酮(azone，az)和丙二醇(propylene glycol，pg)按1∶1（质量比）的比例混合，研究其对lmop凝胶经皮渗透性的影响，为进一步完善lmop凝胶制剂提供实验依据。
1 仪器、药品与材料
1.1 仪器
agilent 1100 series高效液相色谱仪（美国hpchem）；re―52c型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；j―250型水循环真空泵(河南巩义市英峪仪器厂)；tk―6a型franz扩散池(上海锴凯科贸有限公司)。
1.2 药品与试剂
8mop（江苏溧阳市制药厂，批号20040107，纯度>98.5%）；卵磷脂（国药集团上海化学试剂公司，批号20040315）；胆固醇（北京化学试剂公司，批号20040401）；硬脂胺（sigma公司，批号cas8002-43-5）；维生素e（sigma公司，批号59-02-9）；卡波姆-934（bfgoodrich公司，批号cc86gba625）；甲醇（tedia公司，色谱纯，批号403202）；苯扎氯铵（上海化学试剂一厂，批号20040919）；sephadex g―50（pharmacia公司）；药用氮酮(山西芮城兴庆化工厂,批号20041210)；丙二醇(武汉市江北化学试剂厂，批号20040724)；其余试剂均为分析纯。
1.3 实验动物与材料
雄性昆明小鼠，体质量(20±2） g，spf级，湖北省疾控中心提供,许可证号：scxk(鄂)2003―0005；0.45 μm微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)。
2 方法与结果
2.1 离体鼠皮的制备
将小白鼠断颈处死，用剪刀除尽腹毛，剥离腹部皮肤，去除皮下脂肪，洗净后用生理盐水浸泡，并置于4 ℃冰箱中冷藏备用。
2.2 接受液的制备
以含30%(φ)乙醇的磷酸盐缓冲液（pbs，ph6.5，中国药典2005版二部附录）配制。
2.3 凝胶的制备［6］
2.3.1 lmop混悬液的制备
精密称取卵磷脂400 mg，胆固醇200 mg，硬脂胺20 mg，甲氧沙林30 mg，维生素e10 mg，分别溶于30 ml氯仿甲醇（体积比2∶1）溶液中，置于500 ml茄形烧瓶中，加玻璃珠若干颗，于40 ℃水浴上减压旋转蒸发至形成薄膜（a）；取10 ml pbs（10 mmol・l-1）加热至55℃，倾入（a）中，并浸入55 ℃水浴中搅拌30 min，即得lmop混悬液（b）。
2.3.2 lmop凝胶的制备
称取卡波姆100 mg和甘油2 g润湿研匀，加入溶有苯扎氯铵20 mg的水溶液适量，放置，使充分溶胀，滴加三乙醇胺适量调节ph值到6.0～6.5（c）；将lmop混悬液（b）适量加至（c）中，最后加pbs至40 g，搅匀，即得lmop凝胶（d，其8mop含量为0.075%）。另将适量az和pg按1∶1（质量比）混匀，搅拌加入凝胶基质中，再依上法制得含1%（az+pg）透皮吸收促进剂的lmop凝胶（e）。
2.4 hplc法测定8mop含量
2.4.1 色谱条件及分析结果
色谱柱:agilent zorbaxsbc18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇水(体积比70∶30)；流速为0.8 ml・min-1；检测波长为249 nm；柱温25 ℃；进样量:10 μl。
2.4.2 标准曲线的建立
精密称取105 ℃干燥至恒重的8mop对照品适量，加无水乙醇溶解制成10 μg・ml-1的对照品溶液。分别精密量取0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0 ml至10 ml量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。每次进样10 μl，每一浓度进样3次。记录色谱图，测定峰面积，求得8mop的峰面积（a）与进样浓度（ρ）的回归方程：
a=-0.13+0.4278ρ，r=0.9996（n＝3）。
2.4.3 回收率试验
分别称取样品凝胶(d)、(e)各2 g，置100 ml量瓶内，分别精密加入8mop对照品10、40、80 mg，混合均匀，用无水乙醇稀释至100 ml，充分摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤。精密量取续滤液1.0 ml于100 ml量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。吸取10 μl进样，记录色谱图，按回归方程计算8mop的含量。得样品凝胶（d）及（e）的平均回收率分别为1033%，100.4%，99.8%和99.9%，101.4%，1021%。rsd值分别为0.83%，1.02%，1.23%和097%，114%，1.43%（n＝3）。
2.4.4 精密度试验
将两种样品凝胶(d)、(e)配制成含1.0、4.0、8.0 μg・ ml-1 3种浓度的8mop样品溶液，每隔2 h测定1次，计算日内变异。将样品放置5 d，每天测定1次，计算日间变异。测得日内变异rsd值分别为1.08%，0.89%，0.73%和1.03%，064%， 047%（n＝3）；日间变异rsd值分别为094%， 117%，1.09%和1.09%，1.31%，1.49%（n＝5）。
2.4.5 方法稳定性
对各供试液分别在0、2、4、8、12、24、48 h作上述测定，各实验结果无显著性差异(p＞0.05)，表明方法稳定性良好。
2.5 体外透皮渗透考察
2.5.1 体外透皮实验装置及方法
本实验采用franz扩散池装置。将备用鼠皮固定在扩散池的供应室与接受室之间，使角质层面向供应室，上下夹紧后在接受室中注满接受液，驱除气泡。在供应室中分别加入1 g样品凝胶（d）及（e）。开启电磁搅拌器连续搅拌，并保持水浴温度在(32±0.5) ℃。分别在0.5、1、2、5、6、8，12 h取样4 ml，同时补加等量同温的新鲜接受液。
2.5.2 接受液含量测定和累积透皮量的计算
取接受液4 ml经0.45μm微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1.0 ml于100 ml量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。取10μl进样，在249 nm 处测得峰面积，代入标准曲线方程，得接受液浓度，并按以下公式计算累积释药量（q）:ci=f(xi)；q=(ci×vn-1 i=1+ci×4)/s。其中f(xi):标准曲线方程；ci:接受液中药物浓度；v:接受液体积；s：扩散面积。以累积透皮释药量q对释药时间t作图，见图1。
将各样品凝胶体外透皮释药实验结果进行模型拟合，其8mop的累积透皮量（q）与时间（t1/2）之间线性回归具有良好的相关性，各释放参数符合higuchi扩散模式，所得斜率k即为透皮速率常数j(μg・cm-2・h-1)。经方差分析，组间差异有显著性（f＞f0.05），表明透皮促进剂的使用对8mop的经皮促渗作用效果明显，释药状态稳定。结果见表1。表1 样品（d）和样品（e）体外释药的higuchi方程（略）
3 讨 论
3.1 实验全部选择雄性昆明小白鼠可便于取皮操作及结果数据的平行。同时，以高效液相色谱法为离体鼠皮建立了可靠的体外测定方法，使其避免了因长时间浸泡于接受液中，皮肤蛋白质的脱落、溶解而造成接受介质混浊导致的测定干扰，从而保证了较好的基线分离。
3.2 体外透皮实验中水浴设定的温度 (32 ±0. 5) ℃系最接近正常人体表皮的温度。实验中pbs的ph值设定在6.5，一方面是由于该值更接近人体皮肤的ph值，另一方面是由于8mop中所含不饱和内酯在ph＝6.5时最稳定，水解常数最小［7］。因此，以pbs（ph6.5）为水合介质制备脂质体可使脂质体凝胶中的8mop保持在最稳定的范围内。同时，以含30%(φ)乙醇的pbs为透析介质可增大8mop的溶解度，有利于药物浓度的测定。
3.3 本实验凝胶为骨架控释制剂，透皮促进剂要先从基质缓慢扩散至皮肤表面，然后与角质层发生作用，其扩散速率为影响药物渗透的重要因素。氮酮分子直接分配介入角质层的双分子脂质体中，从而破坏其有序叠集排列，导致结构松散，流度增加，使药物分子易于转运，具有较强的透皮促进作用［8］。丙二醇作为促渗剂在单独应用时促渗作用并不明显，并且在较高浓度下随着丙二醇黏度的增加，反而会出现阻滞药物扩散的现象［9］。而丙二醇与氮酮合用则能够产生协同透皮吸收作用：一是由于丙二醇在类脂极性基团之间的亲水区域分布，使氮酮容易分配进入细胞间部位；此外，丙二醇还可以促进药物通过细胞内途径转运，并因此提高氮酮的促进作用［10］。本实验结果显示：含1%（az+pg）的lmop凝胶（e）与不含透皮吸收促进剂的lmop凝胶（d）比较，体外透皮时滞明显缩短，其连续稳态释药促透作用显著。
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