作者：程纪伦, 范爱辉, 苟占平, 典灵辉, 杨丽, 王晓丽
【摘要】 目的研究野生天麻的遗传多样性，为合理利用野生天麻种质资源、为天麻的进一步系统选育研究提供一定的理论依据。方法利用aflp技术，采用8对m+3和p+3引物组合对23份贵州野生天麻品种进行了总基因组dna水平上的多态性检测，用ntsyspc-2.10s 软件的upgma 方法对检测结果进行聚类。结果共获得552条可统计的条带，其中396条呈多态性，多态性带百分率约72%。upgma聚类可以将贵州不同产地的野生天麻很好地区分开来。结论该实验揭示了贵州野生天麻种质丰富的遗传多样性，聚类分析结果表明多数来源地相同的天麻种质表现出较为密切的亲缘关系。
【关键词】 野生天麻； 遗传多样性； aflp
abstract：objectiveto study the genetic polymorphism of wild gastrodia elata bl. in guizhou province, and provide reference for the utilizing its germplasm resources and cultivating new varieties. methodsthe phylogentic relationships among 23 wild gastrodia elata bl. in guizhou were analyzed using aflp to study the genetic diversity with eight aflp primer combinations (m+3 and p+3) . the determined molecular markers were analyzed through upgma method of software ntsyspc- 2.10 s.results552 bands were detected，396 of which were polymorphic, and the high ratio of polymorphic bands (86%) were observed in this study. the dendrogram from the clustering of upgma showed good classification of all population. conclusion our results suggest that wild gastrodia elata bl. in guizhou shows abundant genetic diversities. results of cluster analysis showed that the classification based on aflp markers of wild gastrodia elata bl. in guizhou is consistent with their origin.
key words：wild gastrodia elata bl.； genetic polymorphism； aflp
天麻为兰科(orehidaeae)多年生草本植物天麻gastrodia elata bl.的干燥根茎，为我国传统名贵中药。wWw.11665.cOM 其主要有效成分天麻素具有广泛的药理作用, 具有镇静催眠、抗惊厥、增智、健脑、治疗老年性痴呆症、抗氧化、延缓衰老、增强免疫功能、调节心血管等作用。就天麻遗传学研究来看，传统的研究主要是从形态学方面进行研究。近年来研究主要是运用rapd［1,2］，aflp［2］ ，issr［3］等分子生物学技术对其遗传进化、品种分类鉴定等方面进行研究。野生天麻作为一种重要的遗传种质资源，未见有对其遗传多样性进行研究的报道。本研究利用aflp技术, 以8对引物对23株不同来源的贵州野生天麻基因组dna进行分析,旨在从分子水平上认识贵州天麻野生资源的遗传多样性和其遗传亲缘关系, 为天麻种质资源的收集保存和有效利用提供理论依据。
1 仪器与材料
1.1 材料样品采自贵州不同地区或相同地区的不同居群，均为野生未受人为干扰状态下生长，具体类型和分布见表1；所有样品经贵阳医学院药学院生药学教研室王晓丽教授鉴定。表1 样品编号分类及产地（略）
1.2 仪器与试剂试验中用mseⅰ、pstⅰ、ecorⅰ、t4 dna lingase、rna酶试剂来自neb公司，丙烯酰胺（sigma）、聚丙烯酰胺（sigma），接头和引物由上海生工生物公司合成，taq酶、dntp来自大连宝生物公司。dyc2-20型电泳槽、dyy-12型电泳仪（北京市六一仪器厂），pcr仪（techgene）, 其余为国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 基因组dna制备［4～7］新鲜采集的天麻块茎或地上茎切成小块后用改进的ctab法提取基因组dna，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，并用核酸蛋白测定仪测定dna浓度，将样品用ph8.0te稀释后-20℃冰箱保存备用。
2.2 aflp分析［8，9］
2.2.1 天麻基因组dna的酶切与连接取加入45 μl如下的酶切－连接混和液：ddh2o 37.85 μl；10× neb 2.5 μl；mseⅰ接头(50pmol·μl-1) 1 μl；pstⅰ或ecorⅰ接头（5pmol·μl-1）1 μl；10mmatp 1μl；5μl浓度为100～200 ng·μl-1天麻基因组dna； t4 dna lingase（5u·μl-1）0.4 μl；mseⅰ（10 u·μl-1）0.5μl；pstⅰ或ecorⅰ (10 u·μl-1) 0.5 μl。37℃保温过夜后取5μl酶切－连接产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。
2.2.2 预扩增预扩增pcr反应体系（20 μl）为：ddh2o 10 μl；10×buffer 2 μl；dntp (2 mm) 2 μl；mg2+(20 mm) 1.5 μl；taq酶(2 u·μl-1) 0.5μl；酶切－连接产物 2 μl；引物m00(50 ng·μl-1) 1μl；引物p00或e00(50 ng·μl-1 ) 1 μl。
预扩增pcr反应程序为：95.0℃ 5min－95.0℃ 35s－56.0℃ 35s－72.0℃ 1min－goto step2 30cycles－72.0℃ 5min－4.0℃ 保温。反应结束后取5μl预扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。剩余的预扩增产物用te(ph8.0)溶液稀释20倍后于-20℃保存，以待选择性扩增用。
2.2.3 选择性扩增选择性扩增pcr反应体系（20μl）为：ddh2o 7μl；10×buffer 2 μl；dntp (2mm) 2 μl；mg2+(20mm) 1.5μl；taq酶(2u·μl-1)0.5 μl；稀释20倍的预扩增产物 5 μl；m引物(50 ng·μl-1)1 μl；p或e引物(50 ng·μl-1) 1 μl。
选择性扩增pcr反应程序为： 95.0℃ 5min－95.0℃ 40s－65.0℃（每循环降低0.7℃）40s－72.0℃ 1min－goto step2 13cycles－95.0℃ 40s－56.0℃ 40s－72.0℃ 1min－goto step6 24cycles－72.0℃ 5 min－ 4.0℃ 保温。选择性扩增产物与7 μl的loading buffer混和，95℃变性5 min，立即转移至冰浴冷却，待用。
2.2.4 选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳时，先安装好垂直电泳槽然后灌入1×tbe电泳液，排除点样孔气泡，2 500 v恒压预电泳40 min。预电泳后将7 μl变性后的选扩产物上样于点样孔内，2 500 v恒压电泳至第一条指示剂条带跑至胶板底边时停止，电泳时间约2～3 h。然后银染显带［3］。
2.3 数据统计与分析aflp电泳图谱用gel pro analyzer version 410分析,只记录那些可辨认的、两次扩增结果一致的条带，同一位点有带记为“1”,无带记为“0”，形成0/1矩阵图输入计算机，采用ntsyspc-2.10s 软件的upgma方法对检测结果进行聚类，计算出天麻各样品的遗传相似度。
3 结果
3.1 天麻基因组dna图谱结果见图1。
3.2 aflp结果分析利用从30对引物中筛选出的8对aflp引物对23份野生天麻种质的基因组dna 进行片段长度多态性扩增，获得了较好的扩增结果（见表2）。共扩增出552条谱带（100～700 bp），其中396条具有多态性，占72 %，平均每对引物扩增出69条可统计的带，其中50条具有多态性。可见，aflp检测野生天麻种质资源遗传多样性的效率很高，也充分体现了野生天麻的遗传多样性。结果见图2。表2 8对aflp选择性扩增引物产生的条带多态性（略））
3.3 遗传距离和聚类分析结果见图3。
从图3可以看出，23株野生天麻种质两两间的相似系数分布在0.57～0.85之间，其中21号与23号的相似系数最小，为0.584，表明2种质间的亲缘关系最远。2号与3号、12号与13号、19号与20号的相似系数最大，为0.85，表明这6个种质两两间的亲缘关系最近。以相似系数0.57为标准，23株野生天麻种质可分为a、b两大聚类群，其中红麻和乌麻聚在一起，黄麻和绿麻聚在一起。a聚类群在相似系数0.58附近又分为2个亚类：第1亚类包括18株，在相似系数0.66附近又分为两组，第1组有13株，全部为来自不同产地的乌麻，第2组5株全部为来自不同产地的红麻。说明野生天麻种间变异度比较小。从图3还可以看出多数来源地相同的种质表现出较为密切的亲缘关系，比如来自遵义地区的1、2、3、号聚在一起，来自德江的19、20号聚在一起等。但也有同一来源地的品种未聚在一起的情况，比如来自遵义的1、2、3、4、5、6号没有完全聚在一起。说明同一品种相同地区的种间变异度比较大。第2亚类只有1株，为乌麻品种。b聚类群包括4株，该类包含两个品种黄麻和绿麻，其中7号绿麻与10号和11号黄麻先聚在一起，再与21号绿麻聚合；7号和21号同为绿麻，但是并没有聚在一起，可能是因为产地相距较远。
4 讨论
本试验利用aflp方法分析了23份野生天麻的遗传差异，获得了约72%的多态性位点。邹佳宁等［1］利用rapd研究天麻种质的遗传关系，获得70.97%的多态性位点，与我们得到的结果略有差异。这可能是由于aflp在扩增出丰富的多态性带的同时也扩增出了大量的单态性带，使得其多态性带的百分率并没有明显提高。但平均每对引物所产生的多态性带数（69条）明显高于前者的7.75条。由此可见，aflp标记显然是快速、高效的分子标记。此外，从dna分子水平上来说，遗传多样性越高，表明其遗传背景越复杂，该物种存在的历史越久远。约72%的多态性，说明野生天麻在其遗传进化过程中，基因组dna发生了丰富的变异。同时也揭示了野生天麻种质资源极其丰富的遗传多样性。一个物种的进化潜力和抵御逆境的能力取决于种内遗传变异的大小，遗传多样性越丰富，对环境变化的适应能力越强，其自然分布范围越广。
聚类图中两大群中大部分同一变型、同一来源地的天麻优先聚合，表现出较为密切的亲缘关系。这与天麻野生种源生态条件与生态习性等综合因素有关。但也有同一来源地的品种未聚在一起的情况，这种现象可能是aflp方可反映基因组本质的差异所致。在第一大类中，红麻和乌麻先聚在一起，再与不同产地的乌麻聚为一大类，同样第二大类中黄麻和绿麻先聚在一起，再与其它产地的绿麻聚为一大类，这一方面表明野生天麻种间变异度比较小，红麻和乌麻遗传相似度比较大，黄麻和绿麻遗传相似度比较大。另一方面也反映了不同产地的同一品种间变异度比较大，说明不同的环境因素可能是造成天麻遗传变异的主要因素。此与邹佳宁等对野生和栽培天麻亲缘关系的rapd分析结果有相似之处，邹佳宁等认为，地理分布和生长环境的差异是导致天麻形成丰富的遗传多态性的一个重要的原因。野生天麻种质在长期的自然选择下积累了丰富的遗传变异，遗传组成异常复杂，有必要结合形态与分子分类对野生天麻种质资源进行更深入的研究，以便为野生天麻种质资源利用提供科学依据。此外，不同生态区野生天麻品种间遗传差异相对较大。在进行天麻杂交育种时，应尽可能选择生态类型差异较大的育种材料，以使杂交后代有更多机会出现理想的性状组合，培育出更多更好的天麻新品种。
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