【摘要】 目的 构建常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征（arep）pink1基因真核表达载体，建立稳定表达pink1蛋白的人神经母细胞瘤（sh-sy5y）细胞株。方法 采用聚合酶链反应（pcr）方法，以人胎脑cdna文库为模板扩增pink1基因全长cdna编码区序列，重组dna技术定向插入真核表达质粒pcdna3.1-myc-his(-)b，经酶切和测序鉴定后，用脂质体转染sh-sy5y细胞，通过g418筛选，挑选出稳定转染的单克隆株，经提取gdna进行pcr扩增、反转录-聚合酶链反应（rt-pcr）及western blot 法检测pink1基因在dna、mrna水平及蛋白水平的表达。结果 成功构建了pink1-pcdna3.1-myc-his-(-)b真核表达载体，稳定转染sh-sy5y细胞后，经提取gdna扩增、rt-pcr及western blot检测到了野生型pink1基因在基因组的整合、转录和蛋白水平表达。结论 构建了pink1基因真核表达载体和稳定表达pink1蛋白的sh-sy5y细胞株，为进一步研究pink1基因功能及arep发病机制提供了一个转基因细胞模型。
【关键词】 常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征；pink1；稳定转染；sh-sy5y细胞
establishment of stable expression of wild-type pink1 protein sh-sy5y cell line
yuan xiang-li，zhang yu-hu，liao shu-sheng，et al
1.department of neurology，xiangya hospital of central south university，changsha 410008，china
abstract: objective to construct the eukaryotic expression vector of autosomal recessive early-onset parkinsonism (arep) wild type pink1 gene and to establish human neuroblastoma cell line (sh-sy5y) stably-expressing pink1 protein.methods the full length pink1 cdna fragment was amplified by pcr from the human fetal brain cdna library and eukaryotic expression vector pcdna3.1-myc-his-(-)b was inserted.after the identification by digestion and sequencing analysis,the recombinant vector was transfected into sh-sy5y cell,and the positive mono-clone was screened by g418.the conforming of pink1 in dna level was identified by pcr,pink1 mrna transcription was detected by rt-pcr，pink1 protein expression was assessment by western blotting in the positive mono-clones.results pink1-pcdna3.1-myc-his(-)b eukaryotic expression vector was constructed successfully,and the stable expression of wild-type pink1-transfected sh-sy5y cell line was established successfully.conclusion the construction of stable expression of wild-type sh-sy5y cell line can provide a basis for further research on the function of pink1 and pathogenesis of arep.
key words: autosomal recessive early-onset parkinsonism;pink1;stable transfection;sh-sy5y cell
帕金森病是一种常见的神经系统退行性疾病，大部分呈散发性，致病原因不明，近几年临床和分子遗传学研究发现了呈单基因遗传方式的家族性帕金森病，至少已有7个致病基因被克隆，其中常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征（autosomal recessive early-onset parkinsonism,arep）有3种基因型（park2、park6和park7），致病基因分别是parkin、dj-1和pink1基因［1-3］。wWW.11665.COmpink1基因突变是arep的常见原因，仅次于parkin［4-5］，pink1蛋白定位于线粒体上，由581个氨基酸组成，有1个34个氨基酸组成的线粒体定位结域（mitochondrial targeting motif,mtm）和1个高度保守的蛋白激酶结构域（156～509位氨基酸），pink1基因的功能目前仍不清楚。本研究旨在建立稳定表达野生型pink1蛋白的sh-sy5y细胞株，为进一步研究pink1基因的功能和arep的发病机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
脂质体转染试剂盒lipofectamine tm2000和pcdna3.1-myc-his(-)b购自invitrogen公司；pcdna3.1-myc-his(-)b质粒载体购自invitrogen公司；各种内切酶购自new england biolab公司；质粒提取试剂盒购自qiagen公司；引物合成由上海博亚生物技术有限公司完成；基因组dna提取试剂盒购自tiangen公司；反转录-聚合酶链反应试剂盒购promega公司；dmem培养基购自gibco公司；胎牛血清购自paa公司；omem培养基购自invitrogen公司；g418购自 amresco公司；sh-sy5y由中国科学院生物物理研究所脑与认知国家重点实验室保存；bca蛋白浓度检测试剂盒购自pierce公司；his标签抗体购自santa cruzu公司；羊抗鼠igg购自北京中杉金桥生物技术有限公司；超敏发光液购自pierce公司。
1.2 方法
1.2.1 重组真核表达载体的构建
根据pink1基因cds序列设计2条外引物（pfw-ⅰ和prv-ⅱ），用来做初级pcr，在外引物两侧设计2条内引物（pink1-1-up和pink1-2-dn）用来做次级pcr。在正向引物pink1-1-up加上1个ecor ⅰ酶切位点（gaattc），并加上包含kozak共有序列的起始密码子（accatgg）以增强翻译起始功能；反向引物pink1-2-dn加上1个bam h ⅰ酶切位点（ggatcc），使得次级聚合酶链反应（pcr）产物克隆入真核表达载体pcdna3.1-myc-his(-)b后，融合载体上的myc-his，并使其读框不变。以ecor ⅰ和bam h ⅰ双酶切鉴定，采用通用引物进行3个反应的双向测序鉴定。
1.2.2 sh-sy5y细胞转染
转染前1 d将sh-sy5y接种于6孔板，待细胞生长至60%～70%融合时进行转染，步骤如下：5 μg不同质粒（空载体、野生型）+250 μl omem培养基混匀为a液，12 μl lipofectamine tm 2000+250 μl omem培养基混匀为b液，室温15 min，将a液与b液轻微混匀为c液，室温30 min；将6孔板培养基吸出，无血清无抗生素的dmem培养基洗2遍,将无血清无抗生素的dmem培养基加入c液中轻轻混匀，缓慢加入6孔板中，于37 ℃，体积分数5%co2，100%湿度条件下培养5 h，弃去培养基，换为含血清不含抗生素的dmem培养基，24 h后换为含血清含抗生素的dmem完全培养基继续培养24 h，加入含800 μg·l-1 g418的dmem完全培养基，1周后见对照孔的细胞大量死亡，转染阳性细胞生长状态良好，将转染阳性细胞接种于96孔板，用连续稀释法挑选阳性单克隆细胞，每个96孔板大约可以挑选出6～10个单克隆，待单克隆细胞在96孔中生长至80%融合，用胰酶消化后接种于6孔板中，g418浓度降为600 μg·l-1,待细胞长至80%融合后传入90 mm2培养皿中，待做进一步的鉴定。将稳定表达野生型pink1蛋白的单克隆命名为pink1-sy5y细胞株。
1.2.3 pink1基因dna水平的检测
收集培养细胞，计数约106～107，按照试剂盒说明书提取基因组dna，设计上游引物pink1-myc-his-f：5′-ccaa-gctggctagcgtttaaacg-3′ 融合his标签下游引物pink1-myc-his-r：5′-atggtcgacggcgctattcag-3′，在10 μl反应体系中加入gdna模板1 μl，10×pcr缓冲液1 μl，dntp 0.2 μl，上下游引物各0.3 μl，taq dna多聚酶0.2 μl，pcr h2o补足10 μl，采用touch-down方式行pcr扩增，反应条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃ 60 s；68 ℃ 30 s；每个循环下降1 ℃；72 ℃延伸1 min,10个循环；然后95 ℃、30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃延伸1 min，25个循环；72 ℃充分延伸10 min，扩增产物约为1.8 kb大小，行琼脂糖凝胶电泳。
1.2.4 pink1基因mrna的检测
收集对经测序验证序列正确的单克隆细胞，计数约106～107，按照试剂盒说明抽提制备总rna，应用紫外分光光度计测定总rna 的od值，经琼脂糖凝胶电泳扩增，确定所提取的总rna无降解后，用逆转录试剂盒制备第一链cdna，pcr检测mrna的表达。具体操作步骤如下：采用trizol一步法快速提取重组质粒转染的sh-sy5y细胞的总rna，于55 ℃，60 min合成第1链，以p1、p2为模板，按照rt-pcr试剂盒说明书进行跨外显子rt-pcr的检测。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃延伸1 min，共30次循环；然后72 ℃充分延伸20 min；同时设立空载体转染的sh-sy5y细胞作为阴性对照。目的基因pcr产物用1 g·l-1琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.5 pink1蛋白表达的检测
采用抗his抗体来检测pink1蛋白的表达情况。具体方法为：待细胞生长至90%融合，收集并裂解细胞，测定蛋白浓度，稀释使蛋白浓度为1 mg·ml-1,100 ℃变性5 min,行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，pvdf）膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，与1500稀释的鼠抗his抗体4 ℃摇床孵育过夜，pbs-t洗膜4次，每次15 min，然后与15 000稀释的辣根酶标记的羊抗鼠igg抗体，室温摇床孵育1 h,pbs-t洗膜6次，每次15 min，发光液均匀涂于膜上，曝光3～5 min后显影，将显影条扫描。
2 结果
2.1 重组质粒的酶切鉴定
pink1-pcdna3.1-myc-his-(-)b质粒酶切后野生型pink1产生约1.7 kb的条带，pink1-pcdna3.1-myc-his-(-)b重组质粒中的插入片断与genebank中报道的pink1 cdna序列完全一致,将其野生型命名为pink1-pcdna3.1-myc-his-(-)b。见图1。
2.2 pink1基因dna的表达
转染空质粒载体的sh-sy5y细胞，未扩增出目的基因片断，转染野生型pink1基因的单克隆，扩增片断长度约1.8 kb，并可见转染野生型pink1基因的假阳性克隆,pink1基因cds全长pcr扩增产物见图2。
2.3 pink1基因mrna的表达
提取的总rna od260/280值均大于1.9，经琼脂糖凝胶电泳显示，28s、18s、5s 3条核糖体rna泳带完整清晰，表明总rna无明显降解，见图3。经rt-pcr扩增后的pcr产物可见野生型pink1产生约425 bp的扩增产物，其中未扩增出425 bp产物的为假阳性克隆，正常转染空质粒载体的sh-sy5y细胞组中未见扩增产物表达。见图4。
2.4 pink1蛋白的表达
正常sh-sy5y细胞及转染空质粒载体的sh-sy5y细胞组未见到pink1-his融合蛋白条带，转染野生型pink1-pcdna3.1-myc-his-(-)b重组质粒载体的sh-sy5y细胞组可见特异性的分子量约为62 000的目的条带,见图5。
3 讨论
用转基因技术构建转基因细胞模型是研究帕金森病发病机制的重要途径，目前将基因导入真核细胞的方法有脂质体转染、磷酸钙沉淀等生化转染方法、电穿孔物理转染方法以及病毒介导的转染。阳离子脂质体介导的转染法，容易透过细胞膜，在体外基因转染中有较高的效率，是目前常用的的转染方法之一。作者选择了pcdna3.1-myc-his(-)b 质粒载体来构建野生型pink1真核表达载体，引入标记物his以便于检测。构建的载体pink1-his融合表达蛋白载体，由于pink1蛋白的单克隆抗体来源困难，因此采用抗his抗体来检测pink1蛋白的表达情况。his是一种分子量很小的标记物，大小约为相对分子质量1 000左右，与目的蛋白融合在一起所形成的融合蛋白基本上具有目的蛋白所有的生物学功能，一般不会改变目的蛋白的运输、组装、分泌和代谢等正常生理功能。
pink1基因是2004年克隆的与arep相关的基因［3］，是arep的常见致病基因，仅次于parkin基因，是由581个氨基酸组成的高度保守的钙调蛋白激酶家族成员，是钙调蛋白激酶的类似物，在人脑中广泛表达，定位在线粒体膜上，有1个34个氨基酸组成的n末端线粒体定位结构域和1个354个氨基酸组成的丝-苏氨酸蛋白激酶结构域及1个c-末端自动调节结构域，在体外有自磷酸化作用，pink1蛋白溶解度极低并有聚集的特性［6-8］，这可以解释为什么散发性pd患者中10%的路易体内可以检测到pink1 蛋白。
pink1基因功能缺失突变约占早发性pd患者1%～7%，目前已经有20余种突变报道，pink1基因杂合突变也有报道，被认为也是晚发性pd的危险因素，pink1 基因的发现第1次使线粒体功能障碍与arep间有了直接联系的证据。过表达pink1蛋白可以阻止细胞线粒体膜电位下降及mg123诱导的细胞凋亡［3，9］，而过表达pink1致病突变（e240k，l489p and k219m）可以使pink1功能失活而不能保护细胞在基础及诱导情况下的细胞凋亡。pink1基因突变的表型与parkin非常相似，过表达parkin可以挽救由pink1突变导致的线粒体功能障碍［10-11］。在正常及凋亡应激情况下，过表达野生型pink1基因通过抑制细胞色素c的释放及相应的caspase激活起到抗sh-sy5y细胞凋亡的作用。rna干扰调节的pink1基因失活果蝇模型导致进行性多巴胺神经元丢失，抗氧化剂sod可以抑制这种神经变性，表明pink1基因失活后可以通过氧化应激途径诱导神经细胞死亡。pink1基因很可能通过磷酸化某些线粒体蛋白，调节它们的功能而发挥其保护作用。tnf-受体相关蛋白1，一种线粒体分子伴侣，也被称为热休克蛋白75，是目前报道的pink1的细胞内下游底物，体内体外实验均证实pink1与htrap1在线粒体结合并磷酸化htrap1，保护氧化应激诱导的细胞凋亡，证明pink1对细胞的保护机制依赖于对htrap1的磷酸化［12］。pink1基因功能的进一步研究对于揭示arep的发病机制及靶点治疗具有非常重要的意义。
本研究以人胎脑cdna文库为模板获得pink1基因cdna编码区全长序列，插入到pcdna3.1-myc-his-(-)b真核表达载体内，pink1基因cds全长1 746 bp，5′端gc含量高，二级结构复杂，故采用2次pcr以获得其cds全长，成功构建了野生型pink1基因的真核表达载体，将该载体转染sh-sy5y细胞，经过g418筛选阳性单克隆株，提取全基因组dna进行扩增，并利用反转录-聚合酶链反应、western blotting 检测到pink1基因在dna、mrna水平的整合、转录及蛋白水平的表达。综上所述，本研究成功建立了在基因组dna中稳定整合有野生型pink1-pcdna3.1-myc-his-(-)b载体的sh-sy5y细胞株，为pink1基因的功能研究提供了1个转基因细胞模型，为 pink1基因的功能特性及与arep发病机制之间的关系的研究奠定了基础。
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